Was sind die Probleme bei der Verwendung einer ssDNA oder einer mRNA zur Expression anstelle der Verwendung eines Plasmids?

Nehmen wir an, Sie möchten ein Experiment zum Klonen von Genen durchführen. Sie haben einen leeren Expressionsvektor (mRNA oder DNA) und möchten ein Gen X darin klonieren. Warum kann man X nur kaufen, wenn es sich bereits in einem Vektor befindet (der sich wiederum oft in einem Bakterienträger befindet)?

Was ist das Problem beim Umgang mit reinen mRNA-Nukleotiden des Gens X? Oder sogar sscDNA?

Plasmide sind Vektoren. Das eingefügte Gen wird als Klon bezeichnet oder einfach als Insert, das der Vektor trägt.,
@WYSIWYG Nein, Vektoren sind Vektoren, Plasmide sind Plasmide, in einigen Fällen sind Plasmide tatsächlich Vektoren. Aber buchstäblich ist ein Plasmid nur ein Stück DNA.
Ich meinte die in der Molekularbiologie verwendeten Plasmide, nicht die natürlichen Plasmide.

Antworten (1)

Was ist das Problem beim Umgang mit reinen mRNA-Nukleotiden des Gens X? Oder sogar sscDNA?

Probleme bei der direkten Transfektion einer mRNA/ssDNA

mRNAs können in die Zellen transfiziert werden und werden recht häufig durchgeführt. Das Problem bei der direkten Transfektion von mRNAs besteht darin, dass die mRNA bald abgebaut wird und Sie keine anhaltende Expression haben werden. Dies ist jedoch in bestimmten Fällen sehr nützlich, z. B. bei der Erzeugung von induzierten pleuripotenten Stammzellen (iPSCs), bei denen Sie nicht möchten, dass die Zellen die Yamanaka-Faktoren (von denen einige auch Onkogene sind) kontinuierlich exprimieren.

Außerdem sind RNAs als solche ziemlich anfällig für einen Abbau. Es ist viel einfacher, DNA-Lösungen für lange Zeit herzustellen und zu lagern.

Ähnliche Probleme treten bei einer ssDNA auf.

Warum kann man X nur kaufen, wenn es sich bereits in einem Vektor befindet (der sich wiederum oft in einem Bakterienträger befindet)?

Ein großer Vorteil bei der Verwendung von Plasmiden ist, dass Sie Ihr Gen unendlich vermehren können. Wenn Sie stattdessen eine feste Menge an mRNA erhalten haben, wird Ihnen diese bald ausgehen. Einige Anbieter praktizieren eine solche gierige kapitalistische Politik :P

Wenn Sie eine DNA mit PCR amplifizieren, hat das Klonen weitere Vorteile:

  • Sie können das Gen mit gut standardisierten Primern (wie T7) sequenzieren
  • Sie können Konstrukte herstellen, die das Gen bedingt exprimieren können

Sie haben einen leeren Expressionsvektor (mRNA oder DNA) und möchten ein Gen X darin klonieren.

Sie können nicht einfach etwas innerhalb einer RNA klonen. Sie benötigen spezifische RNA-Endonukleasen. Außerdem ist eine doppelte Verdauung in diesem Fall katastrophal.

Warum Anbieter im Allgemeinen kein dsDNA-Insert verkaufen, sondern es kloniert in einem Plasmid anbieten

  • Eine zirkuläre dsDNA ist stabiler
  • Anbieter können den Bestand des Einsatzes für zukünftige Kunden aufbewahren, ohne erneut PCR durchführen zu müssen
  • Geklontes Insert kann über Bakterienkulturen amplifiziert werden, um sehr hohe Mengen zu erhalten (Maxi/Giga-Preps)
Ich dachte aus einer Workflow-Perspektive. Wenn Sie ein Plasmid kaufen (normalerweise doppelsträngige DNA in Bakterien), müssen Sie zuerst das Plasmid extrahieren, dann den ORF ausschneiden, dann den ORF-Extrakt amplifizieren und an Ihren eigenen Vektor ligieren. Warum verkaufen sie nicht einfach Fläschchen mit ORF? Das sollte auch leicht selbst zu verbreiten sein.
@jiggunjer Nein, Sie kaufen im Allgemeinen keine Bakterienkultur, die das Plasmid trägt. Man bekommt einfach das Plasmid gelöst in Tris-Cl pH 7,5. Lineare DNA, die nur die ORFs enthält, kann sich nicht selbst vermehren. Sie können ein Stück DNA PCR machen, aber mit Bakterienkulturen können Sie eine Menge DNA erhalten (Maxi/Giga Preps). Zirkuläre DNA ist auch relativ stabiler.
Auch wenn man reines Plasmid bekommt, warum nicht reinen ORF. Ich gebe zu, das Argument "nicht kreisförmig ist weniger stabil" klingt ziemlich überzeugend. Ich weiß, dass sie sich nicht selbst ausbreiten können, aber deshalb habe ich den leeren Vektor erwähnt. Also einfach ORF, PCR und Ligatur kaufen. Ich bin nicht sehr erfahren im Labor, aber ich versuche, das Protokoll in den Griff zu bekommen, es scheint unnötig mühsam zu sein.
@jiggunjer Sie erhalten einen leeren Vektor ohne Einfügung. Einige Anbieter verkaufen auch einen vorverdauten/linearisierten Vektor.
@jiggunjer Anbieter verkaufen keine vorverdauten Inserts, da es keinen Standardvektor gibt. Unterschiedliche Vektoren haben unterschiedliche Expressionsstellen, die zum Klonieren unterschiedliche Restriktionsenzyme erfordern. Der Verkauf von ORFs würde bedeuten, dass der Anbieter Hunderte verschiedener Arten von Kombinationen aus klebrigem Ende und Rekombinase-Ende auf Lager halten müsste. Für den Endbenutzer ist es viel einfacher, das Fragment zu PCRen und es zu subklonen.
Was sind die Probleme bei der Verwendung einer ssDNA oder einer mRNA zur Expression anstelle der Verwendung eines Plasmids?
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