Wie kann ich die Ausbeute meiner Gelextraktion verbessern? Wir verwenden das Standardprotokoll von Qiagen, Gelextraktion, lösen in QG-Puffer bei 42 ° C und reinigen über Anionenaustauschersäulen. Bei 500 ng erhalten wir jedoch letztendlich 100 ng für eine Ausbeute von 20%. Ich war neugierig, was sonst noch für die Gelextraktion versucht wurde.
Wir fügen der gelösten Mischung vor der Säulenreinigung auch IPA und NaOAc hinzu.
Als ich die Gelextraktion in meinen Händen optimierte, stellten sich zwei Faktoren als entscheidend für die Maximierung der Gelextraktionsausbeute heraus:
Der pH-Wert der Elutionslösung. Früher habe ich das Endprodukt anfangs mit DEPC-behandeltem Wasser eluiert, aber die Ausbeute schwankte stark, wenn sich der pH-Wert des Wassers änderte. Die Verwendung von Puffer EB ist besser, da er einen stabilen pH-Wert von 8 aufrechterhält.
Am wichtigsten ist, * die Elutionslösung so lange wie möglich mit der Säule inkubieren (und auch zweimal eluieren). * Ich inkubiere etwa 10 Minuten lang, was länger ist als empfohlen, aber es funktioniert viel besser.
Versuchen Sie, sich bei 50 ° C aufzulösen. Im Gelextraktionskit von Qiagen heißt es, sich bei 50 ° C oder bis zur vollständigen Auflösung aufzulösen.
Auch die Größe des Gels ist wichtig. Stellen Sie sicher, dass es 1,5 % oder weniger beträgt und die Größe des Gels weniger als 400 mg betragen muss.
Achten Sie auch auf den ersten Schritt. Wenn die Flüssigkeit nicht dieselbe Farbe wie der erste QG-Puffer hat, liegt ein pH-Problem vor.
Elution von der Säule mit Elution Buffer, der auf 50-60 Grad vorgewärmt wurde. Ich stecke meine für die Dauer der Extraktion in den Inkubator, damit sie warm ist, wenn ich zum Eluieren komme. Es scheint zu helfen, nachzugeben.
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