Sucht die DNA-Ligase nach Komplementarität in klebrigen Enden?

Kann DNA-Ligase zwei nicht komplementäre klebrige Enden versiegeln, wenn die Reaktion unter optimalen Bedingungen inkubiert wird? Ich mache fast 100% Doppelverdau im Labor. Wenn ich jedoch während der Ligation eine Kontrolle ohne das Insert durchführe, erhalte ich immer noch viele zirkularisierte Vektoren, die während der Transformation massive Fehlalarme verursachen. Kann die Ligase, die zwei nicht komplementäre klebrige Enden versiegelt, ein möglicher Grund dafür sein?

Da DNA-Ligase stumpf geschnittene DNA ligieren kann, kann sie wahrscheinlich falsche klebrige Enden ligieren, aber die Wahrscheinlichkeit ist gering. Führen Sie eine antarktische Phosphatase-Reaktion durch, um das 5'-Phosphat auf Ihrem Vektor zu entfernen? Das würde die Wahrscheinlichkeit von schlechten Ligationen verringern.
Leider tue ich das nicht, weil einige Leute das Klonen ohne Phosphatase-Behandlung in unserem Labor zum Laufen bringen können und ich meistens ihren Verfahren folge. Zumindest bisher.
Ich würde auf jeden Fall eine Phosphatasekontrolle versuchen und sehen, ob das das Problem ist.
Möglicherweise erhalten Sie auch aufgrund einer unvollständigen Verdauung falsch positive Ergebnisse. Haben Sie das verdaute Plasmid auf dem Gel überprüft? Verwenden Sie auch sehr wenig des Plasmids (≤500 ng) bei der Ligation
Ich würde auch eine unvollständige Verdauung vermuten. Abhängig von Ihrer Transformationsmethode reichen einige hundert unverdaute Plasmide aus, um falsch positive Ergebnisse zu erhalten, und Sie werden diese in einem Kontrollgel nicht sehen. Sie könnten versuchen, nur die interessierende Bande aus einem Gel zu extrahieren.
Ich verwende ungefähr 300 ng Plasmid für die Transformation. Einige sagen, weniger verwenden, aber sie haben leider keine logische Erklärung. Bezüglich unvollständiger Verdauung: Daran habe ich auch schon gedacht. Da die Stellen zweier Enzyme jedoch sehr nahe beieinander liegen (nur 31 bp zwischen den Stellen, während der Vektor etwa 6 kb groß ist), extrahiere ich beim Extrahieren der geschnittenen Bande aus dem Gel auch einzelne Digests, und es scheint keine Möglichkeit zu geben, sicher zu sein ob ich nur die doppelten Digests extrahiere oder nicht. Ich kann eine Phosphatasebehandlung versuchen, aber haben Sie eine Idee zu der Frage bezüglich der Ligase?
Sie fanden heraus , dass die T4-Ligase nicht übereinstimmende Enden effektiv ligieren kann, was zu bis zu 5 nicht übereinstimmenden Basen führt. Welche Ligase verwendest du?

Antworten (1)

Wenn ich das richtig verstehe, bereiten Sie Ihren Klonierungsvektor vor, indem Sie ihn mit zwei Enzymen verdauen, die 31 bp voneinander entfernt sind. Wenn Sie einen hohen Hintergrund an rezirkularisiertem Vektor haben, prüfen Sie, ob es innerhalb dieser 31 bp eine einzigartige Restriktionsenzymstelle gibt. Wenn dies der Fall ist und dem Fragment, das Sie einzufügen versuchen, diese Stelle ebenfalls fehlt, besteht ein einfacher Ansatz darin, die Ligase zu inaktivieren und die Reaktion mit dem dritten Enzym zu verdauen. Das sollte den Hintergrund des rezirkularisierten Vektors drastisch reduzieren. Wenn Sie nach der Gelreinigung des Vektorrückgrats nach dem Doppelverdau einen signifikanten Hintergrund der Rezirkularisierung erhalten, können Sie Ihre Hypothese über die Ligase, die nicht übereinstimmende klebrige Enden ligiert, leicht testen: Beide Startstellen sollten verschwunden sein und alle Stellen dazwischen sollte weg sein. Hast du das getestet?

Ich habe das Problem gelöst, indem ich die Verdauungszeit verlängert und neue Platten vorbereitet habe. Jetzt bekomme ich nur noch wenige Kolonien, wenn kein Insert vorhanden ist - wahrscheinlich gibt es noch einige einzelne Digests und Ligase repariert den Nick - und es ist kein großes Problem mehr. Ich habe an anderer Stelle über Ihren Vorschlag gelesen, aber es gab nur eine solche Stelle zwischen meinen Stellen und das Enzym dafür war selten und teuer, also folgte ich einem anderen Ansatz, wie ich erwähnte. Anscheinend habe ich falsch positive Ergebnisse erhalten, weil meine Enzyme schlampig und meine Platten etwas alt waren.
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