Restriktionsenzyme, wie werden die Erkennungssequenzen bestimmt?

Diese Veröffentlichung beschreibt ein einfaches Verfahren zur Bestimmung von Restriktionsstellen, das verwendet wurde, um die Restriktionssequenz des zuvor nicht charakterisierten Enzyms aus Haemophilus gallinarum zu bestimmen .

Kurz gesagt, eine bekannte DNA-Sequenz (vom Phagen$\phi \text{X174}$) wird teilweise mit dem Restriktionsenzym verdaut, und die verschiedenen verdauten Fragmente können verwendet werden, um die relativen Abstände zwischen jeder der Restriktionsstellen zu bestimmen.

Dann werden die Restriktionsfragmente unter Verwendung von T4-Polymerase verlängert und unter Verwendung von sequenziert$^{32}\text{P}$als Sanger-Sequenzierung bezeichnet .

Ist die Restriktionskarte des Enzyms auf der bekannten DNA-Sequenz fertiggestellt, können die einzelnen Fragmente dann auf Ähnlichkeiten überprüft werden. Beispielsweise hat Hga I eine Erkennungsstelle außerhalb der Restriktionsstelle. Wenn daher die einzelnen Restriktionsstellen verglichen werden, ist ersichtlich, dass sie alle die Erkennungsstelle aufweisen GACGC.