Für eine DNA-Assemblierung muss ich das Restriktionsenzym SacII verwenden, das mehrere Erkennungsstellen benötigt, um DNA effizient zu schneiden. Nach meinem Verständnis können mehrere DNA-Kopien, die nur eine einzige Restriktionsstelle enthalten, immer noch zur Verdauung führen, indem sie Wechselwirkungen zwischen Molekülen und Enzym überbrücken. Dies scheint jedoch eine Verdauungsoptimierung zu erfordern, die ich lieber vermeiden würde. Kann ich zwei SacII-Stellen hintereinander auf meiner Insert-DNA platzieren, um meine Verdauung zu verbessern? Wie weit sollten diese voneinander entfernt sein, um eine effiziente Enzyminteraktion zwischen den Stellen zu ermöglichen?
In seiner aktiven Form ist SacII (auch Cfr42I genannt) ein Homotetramer, das zwei Kopien seiner Erkennungssequenz binden muss, um sein Substrat effizient zu hydrolysieren. 1 Bei der Bindung zweier Stellen an einem einzelnen Molekül wird die interstitielle Sequenz "herausgeschleift" und gespalten. Die Effizienz der Spaltung ist aufgrund der Sterik der DNA-Biegung eine Funktion der Länge der dazwischen liegenden Sequenz (siehe Ressourcen zur Persistenzlänge von DNA 2 , um die Energetik besser zu verstehen). Eine Studie über die Auswirkungen der DNA-Spannung auf die Schnittfrequenz von Zwei-Stellen-Restriktionsendonucleasen (einschließlich SacII) legt nahe, dass die optimale Schleifenlänge Hunderte von bp beträgt. 3
In jedem Fall enthielt die DNA-Matrize mehrere Erkennungsstellen für die zu testenden Enzyme mit Trennungen im Bereich von etwa 200 bis 1.000 bp, die theoretisch als günstig für Looping vorhergesagt wurden.
Eine andere Studie stellt fest, dass Eco RII, ein weiteres Enzym mit zwei Stellen, sein Ziel mit nur 10 bp zwischen den 5'-Cytosinen seiner beiden Erkennungsstellen spalten kann. 4
Als Alternative zum Entwerfen eines Konstrukts mit mehreren SacII-Stellen könnten Sie Ihren Verdau mit einem dsDNA-Oligonukleotid ergänzen, das eine SacII-Erkennungsstelle enthält. 3
...Stimulation der Aktivität nach Zugabe von kurzen Oligonukleotid-Duplexen, die die Erkennungssequenz enthalten, wurde für Eco57I, HpaII, Cfr9I und SacII berichtet. Eine solche Stimulierung liefert den Beweis, dass ein Enzymkomplex in trans binden kann (dh über zwei Stellen an unterschiedlichen Molekülen).
Wenn Sie diesen Weg gehen, würde ich empfehlen, zuerst SacII mit Ihrem Konstrukt für einige Zeit zu inkubieren, dann die Oligos hinzuzufügen und die Inkubation fortzusetzen. Auf diese Weise verbindet sich SacII mit der Schnittstelle auf Ihrem Ziel, und Sie verringern die Häufigkeit von Ereignissen, bei denen SacII zwei Oligos gleichzeitig bindet und schneidet, was die verfügbare Oligokonzentration verringern und möglicherweise Ihre Zielspaltungseffizienz verringern würde.
Verweise
lästig
JEJS