Synthetisches Konstrukt mit mehreren nicht exprimierenden ORFs

Ich entwarf ein synthetisches Konstrukt auf Papier und ließ es von einer Firma synthetisieren. Das Ziel war die Herstellung eines Vektors, der verwendet werden kann, um sowohl die transkriptionelle als auch die posttranskriptionelle Regulation durch verschiedene cis-Elemente zu untersuchen (2-3 verschiedene cis-Elemente können gleichzeitig untersucht werden).

Das Konstrukt ist so:

SmaI-RES1-CMV-RES1’-GFP-MCS1-SV40PA-Linker-RES2-CMV-RES2’-RFP-MCS2-SV40PA-Linker-RES3-CMV-RES3’- YFP-MCS3-SV40PA-ΔLinker-SmaI

wo:

RES1 = KpnI [GGTACC] 
RES1’= SalI [GTCGAC] 
MCS1 = EcoRI+BamHI [GAATTCTGGATCC] 
RES2 = ClaI [ATCGAT] 
RES2’= NheI [GCTAGC] 
MCS2 = SpeI+HindIII [ACTAGTAAGCTT] 
RES3 = XbaI [TCTAGA] 
RES3’= PvuI [CGATCG] 
MCS3 = NotI+SacI[GCGGCCGCGAGCTC]
Kozak consensus sequence = GCCACCATGG
Linker (100bp) = AATTCTGGATCCTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCGAATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGC

GFP, RFP und YFP sind Fast-Turnover-Varianten mit MODC-Schädlingssequenz. Ich habe die Sequenzen für diese Proteine ​​von der Evrogen-Website genommen. Ich habe die Sv40-polyA-Signalsequenz von einem ihrer Vektoren genommen, um jedes Ereignis einer Inkompatibilität zu vermeiden. Die Kozak-Sequenz wurde auch nur von diesen Vektoren genommen. Die Gesamtgröße beträgt ~4,8 KB. Als CMV-Promotor nahm ich die in den meisten Vektoren verwendete Standardsequenz.

Mit diesem Vektor konnte ich jede posttranskriptionelle regulatorische Sequenz zwischen Stopcodon und SV40PA klonieren und auch Promotoren verändern.

Mit dem CMV-Promotor und ohne 3'UTRs sehe ich eine sehr schwache Expression von GFP, konnte aber keine RFP-Expression sehen. Ich habe pMaxGFP und dsRed als Kontrolle für die Filterempfindlichkeit verwendet.

Ich transfizierte das Plasmid in Hela und Neuro2a und in verschiedenen Konzentrationen (1-5μg) unter Verwendung von Lipofectamin. Die Kontrollen exprimieren gut (jeweils 1 μg transfiziert), aber ich sehe eine sehr schwache GFP-Expression und sehe keine RFP-Expression.

Ich habe den von der Firma bereitgestellten Sequenzierungs-QC-Bericht überprüft und es gab keine Indels oder andere Nichtübereinstimmungen. Ich habe keine Ahnung, warum das Konstrukt nicht zum Ausdruck kommt.

Ist der Linker ein Problem; Reichen 100 bp nicht aus?

Hat das Unternehmen die Sequenz wie oben synthetisiert oder wurde sie für eine Spezies codonoptimiert? Sie können das Falten wirklich vermasseln, wenn Sie mit Übersetzungsgradienten nicht vorsichtig sind. Und wo hast du die Kozak-Sequenz hingelegt? Ich konnte es der Frage nicht entnehmen. Wir müssen sicherstellen, dass wir alles in der richtigen Reihenfolge haben, Gene Start-Stop usw.
Ich habe ihnen gerade die Sequenz gegeben. Sie ist Codon-optimiert für die Expression in Säugetieren. Die Kozak-Sequenz wurde von der ORF-Quelle, dh dem Evrogen-Vektor, erhalten. Die Kozak-Sequenz überlappt mit dem Startcodon, und ich habe einfach die gesamte Sequenz vom Start der Kozak-Sequenz bis zum Stoppcodon genommen
Ich habe zuvor ein GFP + RLuc-Plasmid verwendet, das einen Linker von knapp 100 BP hatte, also denke ich nicht, dass das das Problem ist. Hast du irgendwelche Western oder Northerns gemacht, um zu sehen, ob du eine Art Durchlesen bekommst?
Nein. Ich habe noch keinen Antikörper oder Primer/Sonden. Ich habe auch die Elektroporation ausprobiert. Kein großer Unterschied. Ich werde es noch einmal versuchen und sehen
GFP-Antikörper sind nicht allzu schwer zu finden. Ich könnte versuchen zu sehen, was Ihr grundlegendes Ausdrucksniveau ist. Ansonsten ist die einzige Möglichkeit, die ich kenne, um CMV im Ausdruck zu überschreiten, die Verwendung von T7. Und dann müssen Sie sich um Ihre T7-Quelle kümmern.
Ich bin mir nicht sicher, ob es wegen des Promotors eine schwache Expression ist. CMV-Promotoren sind ziemlich verbreitet und geben eine hohe Expression. Ich frage mich, ob dies bei CMV der Fall ist, wie werde ich andere Promotoren wie Tet-On und UAS verwenden. .. Ich denke, ihre Effizienz ist geringer als die von CMV
@AtlLED: Würden Sie die Punkte zusammenfassen, die Sie in einer Antwort erwähnt haben? Es könnte auch für andere nützlich sein.

Antworten (1)

Ich fürchte, es gibt nicht viel zu antworten, aber zurück auf die Bank mit dir! (Deshalb heißt es Re-Search).

Es gibt mehrere Faktoren, die hier eine Rolle spielen könnten. Sie könnten transkriptionelles oder translationales Durchlesen haben. Sie sollten Ihre Sequenz und die Zellen, in die Sie gehen, überprüfen, um sicherzustellen, dass Sie keine Unterdrückung von Amber (UAG) erhalten.

Bevor Sie irgendetwas tun, sollten Sie Ihre DNA aller Ihrer Gruppen überprüfen. Lassen Sie es ungeschnitten auf einem Gel laufen und stellen Sie sicher, dass der Großteil der DNA Supercoil ist. Die zweit einfachste Sache, die man überprüfen kann, sind Übersetzungsprobleme. Holen Sie sich einen GFP-Antikörper, möglicherweise ein paar, die verschiedene Epitope erkennen, und sehen Sie, ob Ihr GFP die richtige Größe hat. Es kann nicht richtig verarbeitet oder gefaltet werden.

Sie können auf Probleme stoßen, indem Sie die Reihenfolge optimieren. Erstens können synonyme Mutationen Faltungsvarianten verursachen (1). Zweitens könnten Sie einen Haarstift oder eine andere nachteilige Sekundär- oder Tertiärstruktur verursachen. Wenn Sie in Ihrem Western keine Probleme feststellen können, sollten Sie einen Northern in Betracht ziehen, um Fehler bei der Transkription zu beheben.

Wenn Sie alles andere ausschließen und nur einen schlechten Ausdruck bekommen, dann ist die einzige Möglichkeit, die ich kenne, um CMV zu steigern, die Verwendung von T7. Das Problem mit T7 wird immer sein, was für eine Quelle verwendet wird. Wenn Sie BSR/T7-Zellen verwenden können und sie in die Hände bekommen, funktionieren sie großartig. Andernfalls betrachten Sie ein T7-Plasmid oder MVA-T7 als gemeinsame Quellen. Die Plasmide haben in den Händen von niemandem, den ich je gekannt habe, zu einer großen Expression geführt. MVA-T7 funktioniert, aber zu sagen, dass es die Dinge verwirrt, wäre die Unteraussage des Jahres.

Re-search Das ist perfekt.
Kann man dem nicht zugute halten. Ich habe es in den 90er Jahren von einem Berater gehört, und ich würde wetten, dass er nicht darauf gekommen ist.
Es hatte nie die Zeit oder die Ressourcen, um den Vektor zu modifizieren, und gab dieses Projekt schließlich auf. Ich akzeptiere diese Antwort, da sie alle Probleme zusammenfasst und für andere nützlich wäre, die an der synthetischen Biologie arbeiten möchten.
Synthetisches Konstrukt mit mehreren nicht exprimierenden ORFs
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