Die von Mutalik et al. [1] zielen darauf ab, die Kontextsensitivität aus der Übersetzung zu entfernen und somit eine besser vorhersagbare Genexpression sicherzustellen. Mir wurde jedoch gesagt, dass das Vorhandensein mehrerer Transkriptionseinheiten, die jeweils BCDs verwenden, Zellen krank machen kann. Die Erklärung, die mir gegeben wurde, war, dass die Toxizität von kleinen Peptiden herrührt, die durch die Transkription der ersten RBS-Sequenz produziert werden.
Hat jemand Toxizität von mehreren BCDs nachgewiesen oder ist es apokryph? Wenn dies nachgewiesen wurde, ist der Mechanismus der Toxizität bekannt und gibt es eine Möglichkeit, mehrere BCDs zu verwenden und gleichzeitig gesunde Zellen zu erhalten?
[1] VK Mutalik et al., „Präzise und zuverlässige Genexpression über standardmäßige Transkriptions- und Translationsinitiationselemente“, Nat. Methoden, Bd. 10, nein. 4, S. 354–360, April 2013.
Das ist eine großartige Frage und bietet viele Möglichkeiten zum Erkunden. Ich bin mir nicht sicher, ob jemand diese ursprüngliche BCD-Arbeit systematisch weiterverfolgt hat. Wir haben versucht, diese Elemente auf Plasmiden mit mittlerer Kopienzahl zu klonen, in einem Operon-Design, das mehrere Gene antreibt, und jetzt denke ich darüber nach, das war keine kluge Sache. Das Klonen war sehr herausfordernd, wahrscheinlich aufgrund der von Ihnen erwähnten Toxizität. Ich hatte keine Zeit, dies eingehend zu untersuchen (dass es selbst ein cooles Projekt ist), aber ich denke, die Toxizität liegt an zu vielen Ressourcen (Ribosomen?), Die auf diesen Einheiten austitriert werden. Aber das ist eine handgewellte Erklärung. Benötigen Sie eine mechanistische Studie, um dies zu untersuchen. Ich denke, die Gruppe von Tom Ellis und andere haben einige schöne Arbeiten zur Toxizität im Zusammenhang mit der Proteinexpression geleistet. Ich persönlich denke, dass die Toxizität nicht mit dem produzierten inerten Peptid (1. Gen in einem BCD-Operon) zusammenhängt.
Um auf die Verwendung von BCDs zum Steuern mehrerer Gene zurückzukommen, würde ich sagen, wenn Sie diese direkt auf Genomen klonen, sollten sie wie ein Zauber funktionieren. Wir haben das ausprobiert und es funktioniert gut. Nicht viel veröffentlicht (oh Gott, das ist so viel unveröffentlichte Arbeit!) Bakterielle Operons haben diese Verbindungen und Elemente unterschiedlicher Stärke. Gerne besprechen Sie mehr, wenn Sie eine Folgefrage haben !!
Vielen Dank für Ihr Interesse an dieser Arbeit. Wirklich stolz auf unsere Arbeit an diesem System. Natürlich sind wir froh, dass wir diese Arbeit gemacht haben, da es so viele frühe Bemühungen um diese BCD-Typ-Elemente gab. Und ich liebe diese offene Diskussions-SE-Plattform! Ich weiß nicht, wie Synbio ohne dieses System des Wissens- und Erfahrungsaustauschs überlebt hat. Besten Wünsche
Vivek Mutalik
In der Dokumentation für diese neue Klonmethode von Richard Murrays Gruppe bei Caltech (,https://doi.org/10.1021/acssynbio.8b00060) enthalten sie eine Teilebibliothek mit verschiedenen BCDs. Ich habe dies nicht direkt selbst getestet, aber die Warnung, die sie für mehrere BCDs anmerken, ist nicht, dass sie giftig sind, sondern dass sie aufgrund ihrer langen homologen Regionen zur Rekombination neigen. Dies ist sinnvoll, da die Dummy-Peptidregion meiner Meinung nach etwa 50 bp groß ist und von allen BCDs gemeinsam genutzt wird. Sie könnten sich vorstellen, in dieser Region Varianten zu erstellen, um Rekombinationsprobleme zu bekämpfen, aber wer weiß, ob dies die Robustheit des BCD-Ausdrucks beeinträchtigen würde.