Wie kann der CI-Repressor den im λλ\lambda-Phagen gefundenen PRMPRMP_{RM}-Promotor sowohl aktivieren als auch reprimieren?

Es gibt keine Regel, die besagt, dass ein Transkriptionsfaktor entweder ein Repressor oder ein Aktivator sein muss. Der Lambda-Repressor (CI) ist tatsächlich ein Repressor und Aktivator der Transkription, je nachdem, wo er gebunden ist und auf welchen Promotor Sie sich beziehen. Ich weiß, dass sich Ihre Frage nicht direkt auf den Lambda-Phagen bezieht, aber ich denke, dieser Mechanismus lässt sich am besten im Kontext dessen erklären, wo er zuerst erfunden wurde: in der Natur. Daher werde ich versuchen, kurz zu erklären, wie die doppelte Rolle des Lambda-Repressors die Regulierung seiner eigenen Expression ermöglicht und die lysogene Induktion kontrolliert.

Das cI-Gen steht unter der Kontrolle des PRM-Promotors. Der PRM-Promotor ist schwach, da der Sigma-Faktor des Holoenzyms RNA-Polymerase (RNAP) eine geringe Affinität zu ihm hat. Die Bindung von RNAP an PRM und damit die Transkription von dort auf einem vernünftigen Niveau erfordert einen Aktivator. An diesem Prozess ist auch ein anderes Protein namens Cro beteiligt, das ebenfalls die OR-Operatoren binden kann. Das cro-Gen steht unter der Kontrolle des PR-Promotors. PRM ist kein konstitutiver Promotor, da es einen Aktivator benötigt. Ich habe gehört, dass PR konstitutiv genannt wird, weil es ein starker Promotor ist und RNAP ohne einen Aktivator binden kann. Aber gleichzeitig steht es unter der Kontrolle des Lambda-Repressors. Ich nehme an, es hängt davon ab, welche Definition von "konstitutivem Promotor" Sie verwenden.

Die OR-Operatoren sind nicht identisch und daher binden CI und Cro sie mit unterschiedlichen Affinitäten: CI hat die höchste Affinität zu OR1, mit Abstand gefolgt von OR2 und OR3, während Cro OR3 mit der höchsten Affinität bindet. Die Bindung (von zwei beliebigen Molekülen) hängt sowohl von ihrer Affinität zueinander als auch von ihrer effektiven Konzentration ab. Bei niedrigeren Konzentrationen kann CI OR1 und OR2 nur kooperativ binden. Das heißt, jedes Lambda-Repressor-Dimer bindet an ein anderes und bildet ein Tetramer, wobei eine Hälfte OR1 bindet und die andere OR2 bindet. Die Bindung beider Operatoren als Tetramer ermöglicht eine stärkere Wechselwirkung. Bei höheren Konzentrationen kann CI OR3 binden. Darüber hinaus befinden sich OR1 und OR2 im PR-Promotor, während OR3 im PRM-Promotor lokalisiert ist.*

Die meisten Lambda-Gene stehen direkt oder indirekt unter der Kontrolle der PR- und PL-Promotoren (PL ist PR ähnlich, aber der Promotor selbst ist nicht direkt an der cI-Regulierung beteiligt). Wenn Lambda als Prophage existiert, wird seine DNA in das Wirtsgenom integriert und der größte Teil seiner Genexpression wird unterdrückt. Dies erfordert eine CI-Unterdrückung von PL und PR. Wenn die virale DNA zum ersten Mal integriert wird, gibt es kein CI in der Zelle (weil es ein Phagengen ist). Die Expression von cI ist zunächst von einem anderen Promotor (PRE) abhängig, aber darauf gehe ich hier nicht ein. Sobald die CI-Konzentration hoch genug ist, kann es als Tetramer an OR1 und OR2 binden. Die Bindung hier blockiert physikalisch den PR-Promotor und verhindert die Expression von cro (CI wirkt hier als Repressor von PR). Es interagiert auch mit RNAP (eigentlich dem Sigma-Faktor) und erleichtert die Bindung an den PRM-Promotor, was zu einer weiteren cI-Expression führt. Dieser Prozess wird allgemein als Rekrutierung bezeichnet: Da CI fest an die DNA gebunden ist und eine gewisse Affinität zu RNAP hat, kann es eine stärkere Wechselwirkung zwischen der DNA und dem RNAP-CI-Komplex erzeugen. Einfach ausgedrückt induziert es den PRM-Promotor und fungiert somit als Aktivator der cI-Transkription. Wenn die CI-Konzentration zunimmt, bindet es mehr an OR3 (das sich im PRM-Promotor befindet) und unterdrückt den PRM-Promotor, indem es die Bindung von RNAP physikalisch blockiert. Auf diese Weise kann cI sein Expressionsniveau sowohl positiv als auch negativ autoregulieren. es induziert den PRM-Promotor und fungiert somit als Aktivator der cI-Transkription. Wenn die CI-Konzentration zunimmt, bindet es mehr an OR3 (das sich im PRM-Promotor befindet) und unterdrückt den PRM-Promotor, indem es die Bindung von RNAP physikalisch blockiert. Auf diese Weise kann cI sein Expressionsniveau sowohl positiv als auch negativ autoregulieren. es induziert den PRM-Promotor und fungiert somit als Aktivator der cI-Transkription. Wenn die CI-Konzentration zunimmt, bindet es mehr an OR3 (das sich im PRM-Promotor befindet) und unterdrückt den PRM-Promotor, indem es die Bindung von RNAP physikalisch blockiert. Auf diese Weise kann cI sein Expressionsniveau sowohl positiv als auch negativ autoregulieren.

Wenn sich das Lysogen in einer Art Stresszustand befindet, führen normale Wirtsprozesse zur Proteolyse von CI und seine DNA/Sigma-Bindungsdomäne wird von den Dimer- und Tetramerisierungsdomänen abgespalten. Das bedeutet, dass CI nicht mehr oligomerisieren kann und nicht mehr kooperativ an OR1 und OR2 binden kann. Das Ergebnis ist ein Verlust der PRM-Aktivierung (was zu einer stark reduzierten cI-Expression führt) und auch ein Verlust der PR-Repression (was zu einer cro-Expression führt). Cro kann dann OR3 binden und PRM unterdrücken. Das Fehlen einer PR-Repression ermöglicht auch die Expression früher Phagengene (die unter der Kontrolle von PR stehen).

Beachten Sie, dass eine ähnliche Situation in der PL-Promotorregion auftritt und die Bindung von CI sowohl an OR als auch an OL sowie die CI-Oktomerisierung für die Prophagenregulation wichtig ist, aber das scheint noch weiter außerhalb des Bereichs Ihrer Frage zu liegen. Hoffentlich können Sie sehen, wie der Lambda-"Repressor" tatsächlich sowohl als Repressor als auch als Aktivator der Transkription fungiert. Wenn Sie an solchen Dingen interessiert sind, empfehle ich Ihnen dringend ein Lehrbuch namens Molecular Biology of the Gene von Watson et al.

*Zeige Kommentare. Nach weiterer Forschung überlappen die PRM- und PR-Promotoren beide OR2 (Autoregulation and Function of a Repressor in Bacteriophage Lambda, Ptashne et al.), wie das Diagramm im OP zeigt. Es scheint, dass die -35-Region von sowohl PRM als auch PR OR2 um 2 bzw. 3 Basenpaare überlappt. Das veranlasste mich zu der Frage, ob CI, wenn es an OR2 bindet, das sich in PRM befindet, die RNAP-Bindung nicht physikalisch hemmen und somit die Transkription unterdrücken würde? Nun, es scheint, dass CI mit derselben Region von Sigma interagiert, die für die Bindung der -35-Region von PRM verantwortlich ist (Aminosäuresubstitutionen im -35-Erkennungsmotiv von Sigma 70, die zu Defekten in der Phagen-Lambda-Repressor-stimulierten Transkription führen, Kuldell und Hochschild). Anstatt also die Sigma-Bindung hier zu blockieren, wird sie verbessert.

Ich bin versucht zu sagen: "Es ist kompliziert."

CI wirkt tatsächlich sowohl als Repressor als auch als Aktivator. Die Transkriptionsregulation im Lambda-Bakteriophagen ist für ein so kleines System ziemlich komplex, daher ist eine gewisse Verwirrung verständlich. Lewiset al. gibt eine grobe Beschreibung in einer relativ neuen Arbeit ( 1 ):

Das CI-Protein reguliert seine Synthese selbst. Bei niedriger zellulärer CI-Konzentration verstärkt CI seine eigene Synthese aus PRM; wenn hoch, unterdrückt CI PRM (1, 8, 9). Basierend auf den folgenden Beobachtungen wurde ursprünglich angenommen, dass sowohl positive als auch negative Autoregulationen ausschließlich durch die Wirkung von CI-Dimeren an der PRM-OR-PR-Sequenz des Phagengenoms (1, 10) ( 1A ) erreicht werden. (i) Es gibt eine Hierarchie von intrinsischen Bindungsaffinitäten eines CI-Dimers zu einzelnen Operatorstellen: OR1 > OR2 > OR3 (11–17); (ii) CI, das an die intrinsisch schwache OR2-Stelle gebunden ist, wird durch kooperative Wechselwirkungen mit CI verstärkt, das an die stärkere benachbarte OR1-Stelle gebunden ist, und das Ensemble aus zwei CI-Dimeren an den OR1-OR2-Stellen unterdrückt PR und aktiviert PRM (13, 16) ( Abb. 1A); (iii) bei hohen CI-Konzentrationen kann ein CI-Dimer an die schwächste Operatorstelle OR3 binden, Unterdrückung von PRM (1, 2) (Abb. 1C). Übrigens bindet ein zweites Paar von CI-Dimeren kooperativ an OL1-OL2 und reprimiert PL (7).

Die CI-Bindung beeinflusst die Transkription von Lambda-Phagen-DNA durch mehrere Mechanismen, einschließlich DNA-Schleifenbildung zwischen den OR-Operatorstellen an den Prm/Pr-Promotoren und OL-Operatorstellen am Pl-Promotor. Das Verhalten eines manipulierten Transkriptionssystems, das vom Lambda-Phagen stammt, hängt somit davon ab, ob die Möglichkeit einer DNA-Schleifenbildung zwischen diesen Stellen beibehalten wird.

Der Diskussionsteil enthält zusätzliche Erläuterungen:

Unsere Studie bestätigte mehrere oben diskutierte Vorhersagen früherer Forscher über den Mechanismus der Autoaktivierung und Autorepression von PRM, indem die In-vitro-Transkription an supercoiled DNA-Matrizen gemessen wurde, die verschiedene Kombinationen von Operatormutationen enthielten. Unsere Transkriptionsdaten stützen das Modell, dass die Autoaktivierung die Bindung von CI an OR2 erfordert und dass die Aktivierung durch kooperative Dimer-Dimer- und Tetramer-Tetramer-Wechselwirkungen zwischen CI-Molekülen an OR2 und solchen, die an andere Operator-Unterstellen gebunden sind, stimuliert wird. Erstens treten kooperative Wechselwirkungen von CI nicht nur zwischen OR1 und OR2 in cis auf, wie zuvor berichtet, sondern auch zwischen OR1 ∼ OR2 und OL1 ∼ OL2 in trans, was zu individuellen Stellenbesetzungen bei niedrigeren CI-Konzentrationen führt, wie anhand ihrer Auswirkungen auf die PRM-Aktivierung beurteilt . Die trans-Kooperativität durch Oktamerbildung erfordert benachbarte CI-Bindungsstellen zwischen OR1 ∼ OR2∕OL1 ∼ OL2 oder OR1 ∼ OR2∕OL2 ∼ OL3 und nicht OR1 ∼ OR2 und OL1 ∼ OL3 (Abb. S3 F und J). Eine ähnliche Transkooperativität zwischen OR3 und OL3 wird aus der PRM-Repression bei niedrigeren CI-Konzentrationen abgeleitet. Kooperative Interaktionen führen zu DNA-Looping, wenn sie zwischen CI an OL- und OR-Stellen auftreten. PRM wird durch die Bindung von CI an OR3, wie zuvor berichtet (1–3), autoreprimiert, und dies wird durch Dimer-Dimer- und Tetramer-Tetramer-Wechselwirkungen stimuliert, die durch DNA-Schleifen auftreten. Unsere Ergebnisse stimmen mit Revet et al. (18), dass Schleifen per se die Bindung von CI an die Suboperatoren verstärken (Abb. 5). Unsere Arbeit lieferte eine quantitative Bewertung des Beitrags jedes Operators zur Autoregulation.

Puh!

Wenn Sie das von Huang et al. beschriebene System genau modellieren möchten, würde ich mir die Schaltungssequenz sehr genau ansehen und feststellen, welche Teile des Lambda-Phagensystems tatsächlich vorhanden sind. Möglicherweise haben sie bei der Erörterung ihres Systems die neuesten Erkenntnisse über die Regulierung der Pr- und Prm-Promotoren nicht berücksichtigt.

Zur zweiten Frage: Isoliert und ohne vorhandenes CI kann der Prm-Promotor als konstitutiver Promotor verwendet werden ( 2 ). Unter solchen Bedingungen zeigte der Prm-Promotor ähnliche Transkriptionsraten wie der konstitutive Promotor ptet.