Welche Beziehung besteht zwischen der Plasmidkonzentration und dem mRNA-Spiegel?

Angenommen ein einfaches synthetisches Konstrukt, bestehend aus einem konstitutiven Promotor und einem einzelnen Gen:konstruieren

Eine der einfachsten Möglichkeiten, die GFP-Transkription zu modellieren, ist die Verwendung einer ODE:

d [ G F P m R N EIN ] d t = a b [ G F P m R N EIN ]

wo a ist die GFP-Transkriptionsrate und b ist die GFP-mRNA-Abbaurate (beide Konstanten). Normalerweise gehen wir davon aus a >> b .

Angenommen, wir möchten die Plasmidkonzentration mit dem Wert der Transkriptionsrate berücksichtigen a - zB bei höherer Plasmidkonzentration das Verhältnis a / b sollte ansteigen, da erwartet wird, dass die mRNA-Sättigungsniveaus schneller erreicht werden. Mit anderen Worten, angenommen, wir transfizieren 2 individuelle Konstrukte, die oben abgebildet sind, 10 ng von einem und 30 ng von dem anderen – wie sollte sich dieser Konzentrationsunterschied auf die Werte der Geschwindigkeitskonstanten auswirken, vorausgesetzt, die Konstrukte sind ansonsten identisch?

Davon ausgehend, wie hoch ist ungefähr die Gentranskriptionsrate? a Veränderung als Funktion der Menge an transfiziertem Plasmid, das das obige Konstrukt enthält? Idealerweise wäre ich daran interessiert, dies für HEK 293-Zellen zu wissen, aber jede andere anständige Schätzung ist akzeptabel. Eine einfache Möglichkeit besteht darin, einfach eine lineare Beziehung anzunehmen, aber ich denke, das ist zu einfach: zB wenn wir sagen a = 1 bei 10 ng Plasmidkonzentration, dann a = 3 bei 30 ng Plasmidkonzentration. Beachten Sie, dass ich mich nicht unbedingt auf ODE-Modelle beschränke, sondern nur nach einer Art Beziehung suche.

Bisher konnte ich in den von mir durchgesehenen Papieren nichts Nützliches finden, daher wäre ich für jede Hilfe dankbar.

Antworten (1)

Die Menge an transfiziertem Plasmid korreliert überhaupt nicht mit dem Proteinexpressionsniveau. Nach der Transfektion wird normalerweise jede Zelle nur eine Kopie des Plasmids erhalten und behalten. Sobald sich das Plasmid in der Zelle befindet, wird es repliziert und die Zelle enthält X Kopien davon, abhängig von der Kopienzahl des Plasmids. Im Allgemeinen korrelieren Plasmide mit niedriger Kopienzahl im Vergleich zu Plasmiden mit hoher Kopienzahl mit einer geringeren Proteinexpression. Aber es gibt auch Ausnahmen:

Die Expression von Genen unter der Kontrolle des EF1α-Promotors scheint mit der Kopienzahl des Plasmids zu korrelieren. Im Gegensatz dazu scheint die durch den traditionelleren CMV-Immediate-Early-Promotor gesteuerte Expression weniger auf die Dosis der Plasmidkopienzahl anzusprechen (Ref) .

Nun, die Exemplarnummer spielt auch bei CMV eine Rolle. Ich hatte eine normalisierte Luciferase-Aktivität in HEK-Zellen bei unterschiedlichen Mengen an transfiziertem Plasmid beobachtet – es zeigt einen Unterschied. Auch die Wirkung einer miRNA auf die Luciferase ist mit abnehmenden Konzentrationen besser. Es ist jedoch nicht streng linear.