Wir vermuten, dass ein bidirektionales Transkriptionsereignis an einem Ort in unserem Organismus stattfindet, an dem zwei Gene direkt benachbart sind. Die Annotationsdaten sind nicht gut etabliert. Der intergenische Abstand beträgt wahrscheinlich weniger als 200 Basenpaare.
Die beiden Gene werden in entgegengesetzter Richtung zueinander exprimiert. Basierend auf den vorläufigen Transkriptomikdaten scheint es, als würde ein Gen zu viel in das benachbarte Gen transkribieren (3' UTR vielleicht?), was möglicherweise zu einer Art Transkriptionsregulation des benachbarten Gens führt.
Hier ist ein grobes Diagramm dessen, was unserer Meinung nach passieren könnte:
------------------------==========gene A================>----------------------
----------------------------------------<====gene B=====-----------------------
Natürlich müssen wir dies zuerst bestätigen, indem wir Primer entwerfen, um zu sehen, ob diese Übertranskription tatsächlich stattfindet.
Wenn dies geschieht, beabsichtigen wir, einige Knock-Down-Experimente durchzuführen. Wir haben in unserem Organismus keine Transgenese zur Verfügung, nur RNAi durch dsRNA. Es ist möglich, GenA spezifisch niederzuschlagen, indem man dsRNA in die 5'-Region von GenA einführt, die nicht mit GenB überlappt. Möglicherweise führt dies zu einer ektopischen/Überexpression von GenB.
Gibt es überhaupt GeneB gezielt niederzuschlagen, ohne GeneA niederzuschlagen? Es sieht so aus, als würde das Entwerfen von dsRNA für GenB sowohl A als auch B niederschlagen.
Wie gut ist Gen A annotiert? Haben Sie die Gen-A-Sequenz (nach posttranskriptionellen Modifikationen)? Wenn Sie dies tun, können Sie es bei einer Firma wie DNA2.0 bestellen und sie werden es für etwa 0,35 $/Basis für Sie synthetisieren. Dann können Sie die Zellen mit diesem Plasmid transformieren und Gen B ausschalten, indem Sie eine Sequenz an der Überlappung von ~ 200 Basen einfügen.
Ich denke auch, dass Sie das unmittelbare Transkript (ohne Änderungen) transformieren können. Es wird auch modifiziert, sobald es in der Zelle ist. Die Synthese wird jedoch länger und teurer sein, aber es gibt einige Methoden, mit denen Sie dies tun können.
Lassen Sie mich wissen, ob Ihnen diese Idee zusagt. Bei Interesse kann ich dir mehr Infos geben.
Wenn Gen B ein Proteinprodukt herstellt, können Sie versuchen, ein Morpholino gegen die 5'-UTR von Gen B zu entwickeln. Dies kann die Translationsinitiierung am Ribosom verhindern, da das Morpholino den mRNA-Eintritt in das Ribosom blockiert. Sie können dies durch Western Blotting erkennen.
Wenn Gen B eine Art Regulator-RNA herstellt, müssen Sie die Expression von Gen B auf DNA-Ebene anvisieren. Wenn Gen B gut etablierte Spleißstellen hat, kann ein Morpholino Splicing-Enhancer und Silencer stören und sollte daher ein nicht-funktionelles oder beeinträchtigtes RNA-Produkt produzieren. Sie können Spleißvarianten nachweisen, indem Sie Gen B aus cDNA amplifizieren.
Theoretisch liegt der Vorteil der Verwendung eines Morpholinos in seiner einzelsträngigen Natur. Morpholinos, die gegen Gen B entwickelt wurden, sollten aufgrund der fehlenden Komplementarität keine Wirkung auf Gen A haben.
Gergana Vandova
Damian Kao
Benutzer59
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