Die Sequenz der Restriktionsstelle von EcoRI - GAATTC wurde in den frühen 1970er Jahren identifiziert, bevor die Sanger-Sequenzierung erfunden wurde (1977).
Wie wurde die Restriktionsstelle von EcoRI sequenziert?
Die erste Bestimmung einer Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonulease wurde berichtet in:
Kelly & Smith (1970) Ein Restriktionsenzym aus Hemophilus influenzae II. Basensequenz der Erkennungsstelle. J Mol. biol. 51: 393-409
Das Enzym hieß damals Endonuclease R, ist aber heute als HindII (oder HincII) bekannt.
Das verwendete Verfahren bestand darin, DNA mit dem Enzym zu schneiden und dann die exponierten terminalen Phosphate mit alkalischer Phosphatase zu entfernen. Diese Enden konnten dann unter Verwendung von Polynukleotidkinase und γ-markiertem ATP mit 32 P markiert werden.
Die endmarkierte DNA wurde dann auf drei verschiedene Arten mit Nukleasen behandelt, um Mononukleotide, Dinukleotide und eine mit Trinukleotiden angereicherte Mischung freizusetzen. In jedem Fall wurden die markierten Produkte durch ihr Verhalten in der 2D-Dünnschichtchromatographie identifiziert und gegebenenfalls weiter hinsichtlich ihrer gesamten Basenzusammensetzung nach Verdau zu Mononukleotiden charakterisiert.
Der abgeleitete Standort war/ist
5'----GTY RAC----3'
3'----CAR YTG----5'
Somit wurden die markierten Mononukleotide als A und G (Purin = R) gefunden, die Dinukleotide als GA und AA und so weiter.
Die EcoRI-Sequenz wurde im Wesentlichen durch die gleiche Methodik bestimmt und wurde von berichtet
Hedgpeth et al. (1972) DNA-Nukleotidsequenz, die durch die RI-Endonuklease eingeschränkt wurde. Proz. Natl. Akad. Science USA 69:3448–3452
Nachtrag:
Obwohl die Sanger-Sequenzierung (die Plus-Minus-Methode) möglicherweise in den 1970er Jahren entwickelt wurde, hat sie sich erst in den frühen 80er Jahren wirklich durchgesetzt. So war zum Beispiel die erste vollständige Plasmidsequenz, die 1979 bestimmt wurde, pBR322:
Sutcliffe (1979) Vollständige Nukleotidsequenz des Escherichia coli-Plasmids pBR322. CSH Symp. Menge biol. 43: 77 - 90
"Ich habe die 4362-Nukleotidpaar-Sequenz des Plasmid-Klonierungsvektors pBR322 unter Verwendung der DNA-Sequenzierungstechnik von Maxam und Gilbert (1977) bestimmt. Die DNA-Struktur weist mehrere interessante Merkmale auf, die zu überprüfbaren Vorhersagen führen."
Die damals verwendete Standard-Sequenzierungsmethode war die chemische Sequenzierung unter Verwendung der Maxam-Gilbert-Methodik. Als ich 1979 als Postdoc in den USA anfing, war die MG-Sequenzierung die Standardmethode. Die Sanger-Sequenzierung nahm erst nach der Entwicklung der M13-mp-Vektoren (und später der pUC-Plasmide) durch J. Messing in den frühen 80er Jahren wirklich Fahrt auf. Und was für eine Erleichterung: Die MG-Sequenzierung war extrem mühsam, wie jeder, der sie jemals gemacht hat, bezeugen wird.