Frage zur Gelelektrophorese

Leena ist Studentin der Molekularbiologie. Sie reinigt zwei DNA-Fragmente, 800 und 300 Basenpaare lang. Diese wurden von einem Plasmid erhalten, nachdem es mit HindIII verdaut worden war. Jedes dieser Fragmente hat eine einzelne EcoRI-Erkennungsstelle. Leena möchte diese beiden Fragmente verbinden, um ein 1,1-kb-Gen zu erhalten, wie in Abbildung 7.1 gezeigt. Sie vermutet, dass dieses Gen eine einzigartige proteinkodierende Sequenz hat.

Sie mischt daher die beiden Fragmente in Gegenwart von überschüssiger DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer und inkubiert die Mischung. Sie entnimmt nach 30 Minuten ein Aliquot (ein kleiner Teil der Reaktionsmischung) und trägt es auf ein Agarosegel, um die Ergebnisse zu überprüfen. Sie ist überrascht, viele Banden zusammen mit der erwarteten 1,1-kb-Bande im Gel zu finden.

Abb. 7.1

ABB. 7.1

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Leena interessiert sich für das in Abbildung 7.1 gezeigte 1,1-kb-Fragment. Daher eluiert sie das 1,1-kb-Fragment aus dem in Abbildung 7.2 gezeigten Gel und unterzieht einen Teil dieser Probe einem HindIII-Verdau. Sie erhält das erwartete Muster mit zwei Banden, 800 und 300 Basenpaare lang. Um die Restriktionskarte zu bestätigen, unterzieht sie die verbleibende Probe einem vollständigen EcoRI-Verdau. Welches Bandmuster würde sie erhalten?Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Die gegebene Antwort lautet wie folgt, und ich verstehe, warum dies die Antwort ist, und andere in der Frage angegebene Optionen (hier nicht gepostet) sind definitiv nicht die Antwort, aber ich verstehe nicht, warum es hier keine 0,4-kb-Fragmente, 1,1-kb-Fragmente gibt.

Antworten (2)

@A. Kennard ist mir zuvorgekommen. Hier ist meine Antwort unter der Annahme einer vollständigen Verdauung. Die zwei HindIII-Fragmente können ligiert werden, um vier verschiedene Produkte zu ergeben, wie unten gezeigt. Ich habe ein Ende jedes HindIII-Fragments markiert, um beim Erkennen der Polarität zu helfen, und ich habe die ligierte Verbindung als Lücke belassen, um zu helfen, zu sehen, was vor sich geht. Ich verstehe den Punkt mit der 1-kb-Band nicht.

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Schöne Grafik! Ich hatte einen Tippfehler in meiner Antwort, ich wollte damit sagen, dass es möglich sein sollte, wenn Sie davon ausgehen, dass die Verdauung unvollständig ist, zusätzlich zu den 0,4-kb- und 1,1-kb-Banden, wenn Sie nicht an einer Schnittstelle schneiden, um eine zusätzliche 1-kb-Bande zu erhalten, die nicht vorhanden ist im Fall der vollständigen Verdauung.

Sie sind zu schlau für diese Frage ;) Wenn Sie davon ausgehen, dass das Enzym perfekt ist, Sie die Menge an Template optimiert haben und die Reaktion sehr lange stehen lassen, dann wird es eine vollständige Verdauung geben . Wenn Sie von einer vollständigen Verdauung ausgehen, werden keine 1,1-kb-Fragmente vorhanden sein. Wenn Sie außerdem alle möglichen Orientierungen der 800 bp und 300 bp ausarbeiten, die miteinander ligiert wurden (jedes Stück kann in der gezeigten Orientierung und in der entgegengesetzten Orientierung sein) und Sie einen EcoRI-Schnitt an jeder verfügbaren EcoRI- Stelle erzwingen, dann werden Sie es nicht tun auch keine 0,4-kb-Fragmente aus unvollständigem Verdau aufweisen.

In Wirklichkeit war ich nie in der Lage, meine Reaktionsbedingungen zu optimieren, um eine vollständige Verdauung meiner Vorlage zu erreichen, und ich habe immer eine Restvorlage in der Nähe, also ist es gut, dass Sie so für die Vorbereitung in der "realen Welt" denken.

Wenn Sie nicht von einer unvollständigen Verdauung ausgehen, sollte es zusätzlich zu den 1,1-kb- und 0,4-kb-Banden, die in diesem Gel fehlen, auch eine 1-kb-Bande geben.

Edit: Ich habe den letzten Absatz vermasselt. Es sollte lauten: „Wenn Sie nicht von einer vollständigen Verdauung ausgehen, sollte es zusätzlich zu den 1,1-kb- und 0,4-kb-Banden, die im vollständigen Verdauungsgel fehlen, meiner Berechnung nach auch eine 1-kb-Bande geben.

Ich stimme @Alan Boyd zu. Auch ich verstehe nicht, warum 1kb da sein sollte?
Ich hatte einen Tippfehler. Ich wollte sagen "wenn Sie nicht von einer vollständigen Verdauung ausgehen." Sehen Sie sich eines der möglichen Restriktionsprodukte an, die @Alan Boyd angezeigt hat. Wenn Sie 800-bp- und 200-bp-Produkte (oder 700 und 300 oder 900 und 100) mit vollständigem Verdau erhalten, erhalten Sie ein 1-kb-Produkt mit unvollständigem Verdau. Sorry für die Verwirrung!
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