Wir führten eine PCR mit einer positiven Kontrolle und zwei Probenspuren durch. Wir haben die gleiche Probe verwendet, aber in einer PCR-Mischung haben wir ein Gesamtvolumen von 50 μL (25 μL Taq, je 5 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 10 μL Probe, 5 μL dH2O) verwendet, während wir in der anderen jedes Volumen auf insgesamt 25 μL halbiert haben. Das Pipettieren wurde von derselben Person durchgeführt.
Die positive Kontrolle und die 25-μl-Gesamtvolumenspur ergaben schöne und klare Banden, aber die 50-μl-Probe zeigte nichts. Wie könnte das erklärt werden?
Bearbeiten: Wir haben nur eine PCR mit allen Proben gleichzeitig durchgeführt, also kein zweiter Thermocycler oder unterschiedliche Temperaturen oder so. Habe diese Möglichkeit gar nicht in Erwägung gezogen!
Bearbeiten 2: Falls es relevant ist, haben wir dies verwendet: http://www.chemheritage.org/discover/collections/collection-items/scientific-instruments/perkin-elmer-cetus-model-480-dna-thermal-cycler .aspx
Der Thermocycler passt die Probentemperatur basierend auf dem Volumen der Probe an. Wenn Sie also Proben mit unterschiedlichen Volumina nebeneinander laufen lassen, durchlaufen nicht alle die optimalen Temperaturen für jeden Schritt. Wenn Sie mit einer "Hot-Start"-Polymerase arbeiten, ist dies noch kritischer, da das Taq überhaupt nicht amplifizieren kann, es sei denn, die Probe wird auf eine bestimmte Temperatur erhitzt.
Gergana Vandova