PCR-Produkte ohne Bande im Gel

Ich bin ein Doktorand und blieb bei den Gel-Ergebnissen bei der No-Bande hängen.

Ich verwende folgendes

  • 1 Mikroliter Primer R (20 mM)
  • 1 Mikroliter Primer f (20 mM)
  • 1 Mikroliter dNTP (10 mM)
  • 1 Mikroliter DNA-Template (448 ng)
  • 1 Mikroliter TAQ-Polymerase
  • 5 Mikroliter Puffer (10x) mit MgCl2 im Verhältnis 1:1
  • 30 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität

Programm:

  • 95 für 4 Minuten
  • 95 für 45 Sek
  • 55-65 für 1,20 Minuten
  • 72 für 1 Minute
  • Gradient 35 Zyklus
  • 72 für 4 Minuten

Gel:

110 Volt, 200 mPA für 30 - 45 Minuten

Ich bekomme PCR-Produkte wie auf den Bildern. Es gibt keine Bänder, während es am Boden und in einigen der Vertiefungen intensive Bänder gibt.

Meine Frage ist, ist das bei den unteren Produkten?? Was kann getan werden, um sie wahr werden zu lassen? Wenn nicht, warum gibt es Unterschiede zwischen den beiden Brunnenspuren? Jede 12 Vertiefung repräsentiert eine Art von DNA-Matrize (ich habe drei verschiedene Organismen-DNA verwendet).

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Erstens: Ihre PCR funktioniert im Prinzip, die Banden unten sind schöne Primer-Dimer-Banden, die dies anzeigen. Dann: Was ist die Quelle Ihrer DNA und wurde sie jemals erfolgreich für die PCR verwendet? Wie wird es gemacht?
Hallo Chris, danke für deine Antwort. Die DNA stammt von LLactobacillus- und Lactococcus-Bakterien. Die Grundierung wurde basierend auf beiden als degeneriert konzipiert. Bis jetzt konnte ich die PCR-Arbeit nicht bekommen.
Leiter sieht gut aus...
Können Sie die Sequenz, die Sie amplifizieren möchten, und die Sequenzen der Primer, die Sie verwenden, posten? Haben Sie auch eine positive Kontrolle für den Taq?
Verwenden Sie genomische DNA? Dann können Sie versuchen, das Ergebnis zu verbessern, indem Sie entweder weniger Templat verwenden oder zusätzliches MgCl2 hinzufügen. Sie können auch verschiedene PCR-Methoden ausprobieren (z. B. Spike-PCR oder Touchdown).

Antworten (5)

Verwenden Sie Kontrollprimer, die auf etwas abzielen, das mit Sicherheit ein Produkt ergibt. Wenn Sie keine haben, fragen Sie Ihre Kollegen oder nehmen Sie etwas aus der Literatur. Stellen Sie sicher, dass Ihr Produkt klein genug ist, um in der angegebenen Zeit amplifiziert zu werden, und prüfen Sie mit einem Restriktionsenzym auf die richtige Bande.

Ich bin mir über den Maßstab Ihrer Leiter nicht sicher, aber unabhängig davon ist die DNA, die die Streifenbildung verursacht, sehr klein. Sie sind höchstwahrscheinlich Primer-Dimere. Ich würde die Primersequenzen überprüfen, um sicherzustellen, dass es nicht viel Komplementarität gibt. Sie können auch versuchen, Reaktionsbedingungen wie die Konzentration von Magnesiumchlorid oder die Primer selbst usw. zu manipulieren. Ich würde einen Optimierungssatz von PCRs mit variablen Reaktionsbedingungen durchführen.

Meine erste Vermutung wäre, dass Sie für diese Bedingungen zu viel Template-DNA verwenden. Deine Vertiefungen leuchten ziemlich stark, 448 ng sind auch auf der hohen Seite.

Versuchen Sie es mit niedrigeren Konzentrationen an Template-DNA (1-100 ng), vielleicht nur mit einem 55 °C-Annealing-Schritt. Im Moment haben Sie überhaupt kein Produkt, also würde ich mir noch keine Gedanken über Unspezifität machen (und 10 °C ist auch ein ziemlich kleiner Bereich, um das zu beheben).

Andere Dinge, die auffallen:

  • Ich nehme an, es ist 20 uM Primer, nicht mM
  • Sie fügen zu viel Puffer hinzu
  • Es sieht so aus, als würden Sie jede Reaktion einzeln durchführen (wenn Sie sich die Vorlagenmengen in den ersten 12 ansehen). Ich schlage vor, einen Mastermix zu erstellen und diesen zu aliquotieren.
  • Sie haben ziemlich viel Platz, um Ihr Gel länger laufen zu lassen, das könnte sehr nützlich sein, wenn Sie etwas Produkt bekommen.

Ein bisschen mehr Infos solltest du auch haben. Welche Größe erwarten Sie von den Produkten? Verwenden Sie Organismen mit hohem GC? Haben diese Primer vorher bei anderen Leuten funktioniert? Hat die genomische DNA zuvor bei anderen Menschen funktioniert?

NEB hat viele nützliche Informationen über PCR und andere DNA-Arbeiten auf ihrer Website, siehe: https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with -taq-DNA-Polymerase

Was Sie ausprobieren können, sind verschiedene Pufferlösungen (10 x), auch mit oder ohne MgCl2. In dem Labor, in dem ich früher mit PCR gearbeitet habe, hatten wir eine Reihe verschiedener PCR-Puffer im Gefrierschrank. Wir haben einige von ihnen getestet, um zu sehen, welche am besten passt (daher gab es die richtige Größenband). Genau wie Ihr Temperaturgradient, um zu sehen, welcher am besten funktioniert.

Sie können eine Touchdown-PCR ausprobieren . Es ist oft hilfreich, wenn keine Band anwesend ist.

PCR-Produkte ohne Bande im Gel
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