Gibt es eine biologische Erklärung für einen Unterschied von 0,5 in der Allelgröße mit PCR-Produkt?

KONTEXT

Ich arbeite derzeit an einer Reihe von Diversität, diese Diversität in interspezifisch (innerhalb derselben Gattung). Ich verwende SSR-Marker, die Primer wurden für eine Art entwickelt und funktionieren innerhalb der Art sehr gut (viel Vielfalt und Unterschied zwischen Allelen von mindestens 1).
Wenn ich sie an den anderen Arten ausprobiere, beobachte ich die normale Nicht-Amplifikation, die auf eine Mutation in der Primer-DNA-Sequenz zurückzuführen sein könnte. Aber bei einigen Genotypen habe ich ein neues Allel genau zwischen den beiden älteren beobachtet (wie das neue 185,5 ist und die älteren 185 und 186 waren.

FRAGEN

Ist diese Art von Beobachtung häufig, wenn Zündhütchen verwendet werden, die für andere Arten entwickelt wurden?
Ich verstehe, wie ein Unterschied von 1 pb auftreten kann CACACA==> CACCACA, aber was könnten die biologischen Erklärungen für einen Unterschied von 0,5 pb zwischen Allelen sein?

Antworten (1)

Nach meiner Erfahrung, die mit einem ähnlichen Ansatz bei Campylobacter jejuni arbeitet , sind die Basenpaarmessungen aus diesen Techniken ungenau und müssen sorgfältig kalibriert werden. Ich bin nicht überrascht, Unterschiede von 0,5 Basenpaaren zu sehen, dies kann gesehen werden, wenn Läufe und gerade, im schlimmsten Fall, zwischen geraden und ungeraden Vertiefungen in derselben Platte (!) gewesen sind.

Ich würde die Sanger-Sequenzierung verwenden, um die Sequenz zu bestimmen, die Sie in einem Ihrer Isolate erhalten, und diese dann als Kalibrierungskontrolle verwenden, die in jedem Lauf enthalten ist.

Vielen Dank für Ihr Feedback! Ich hatte vor, eine Sanger-Sequenzierung durchzuführen, um das Problem zu verstehen. Das Allel ist jedoch ziemlich stabil (gleiche Länge auf verschiedenen Platten). Normalerweise sehe ich alle meine Allele in einer Variation von 0,5 pb um den tatsächlichen Wert, abhängig von Genotypen/Läufen.
@Untitpoi Wir haben festgestellt, dass Targets unterschiedlicher Länge aus demselben Stamm und dieselben Targets aus verschiedenen Stämmen häufig Ergebnisse mit unterschiedlichen Längen lieferten.
@Untitpoi Ich denke, es tritt auf, weil Unterschiede in der Sequenz geringfügige Unterschiede in der Mobilität während der Kapillarelektrophorese verursachen. Wenn Sie sich die Rohdaten aus einem Sequenzierungs-Read ansehen, können Sie sehen, dass die Peaks weniger regelmäßig erscheinen als die geglätteten verarbeiteten Peak-Daten, die Sie normalerweise betrachten. Ich würde vermuten, dass es aufgrund der physikalischen Eigenschaften der Nukleotide konsistente Unterschiede im Verlauf der Sequenzen gibt.
Gibt es eine biologische Erklärung für einen Unterschied von 0,5 in der Allelgröße mit PCR-Produkt?
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