Wie klont und sequenziert man ein Gentranskript mit unbekannter Sequenz?

Wie könnte ich vorgehen, um ein Gentranskript (mRNA) aus tierischem Gewebe zu amplifizieren, dessen Genom wenig bekannt ist? In einigen Anwendungen habe ich Reverse-Transkriptase-PCR verwendet, um alle mRNA-Transkripte aus kultivierten Zellen zu amplifizieren, aber dies erforderte, dass ich die Sequenz zur PCR-Amplifikation kannte.

Wie mache ich das ohne Kenntnis des Gens oder Transkripts?

Kennen Sie die Funktion des Gens? Was ist der Zweck Ihres Experiments?
Ich weiß, dass es ein endokrines Hormon ist, und ich kann Parallelen zur menschlichen Endokrinologie ziehen, aber darüber hinaus weiß ich nicht viel darüber (und es scheint auch nicht viel in der Literatur zu geben). Der Zweck ist wirklich nur zu sehen, wie konserviert die Orthologen der Säugetiere im Vergleich zu Eidechsen sind.
Die Hormonsequenz zu haben, hilft ein wenig. Obwohl Sie nicht ganz unvoreingenommen sind, könnten Sie versuchen, Ihre Sequenz durch Amplifikation aus einer konservierten Region anzureichern.
Ja, Bobthejoe hat Recht: Suchen Sie einfach in Google nach "homologiebasiertem Klonen".
@bobthejoe - danke, ich werde nach homologiebasiertem Klonen suchen. Ich vermute, dass es zwischen Menschen und Eidechsen eine ziemliche Menge (50%) an Naturschutz gibt, also werde ich sehen, ob dieser Weg zu einem sinnvollen Ergebnis führen kann.

Antworten (1)

Vielleicht können Sie sich von klassischen Artikeln zum Lambda-Klonen inspirieren lassen: Maniatis T, Hardison RC, Lacy E, Lauer J, O'Connell C, Quon D, Sim GK, Efstratiadis A . 1978. Die Isolierung von Strukturgenen aus Bibliotheken eukaryotischer DNA. Zelle 15: 687–701.

Versuchen Sie, Gewebe von dem Tier auszuwählen, von dem Sie glauben, dass es für das spezifische Gen, nach dem Sie suchen, „angereichert“ (dh stark exprimiert) ist. Dies kann ein wenig Raten erfordern. Wenn zum Beispiel Gen A sehr stark in Gewebe B exprimiert wird, dann können Sie "annehmen", dass die meisten mRNA-Transkripte für das von Gen A bestimmt sind. Führen Sie eine RNA-Reinigung, RT-PCR durch und klonieren Sie die cDNA in Lambda-Vektoren und Plaketten auswählen. Mit etwas Glück können Sie das Gen durch Klonen, Hybridisierung und anschließendes Chromosomen-„Walking“ identifizieren, um seinen strukturellen Ursprung zu bestimmen.

Dies geschah damals, um neue Gene zu identifizieren, lange vor Genomik, Sequenzierung oder sogar PCR!

Das ist ziemlich toll. Danke für den Hinweis und die Erklärung jp89.
Wie klont und sequenziert man ein Gentranskript mit unbekannter Sequenz?
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