Wie wählt man PCR-Bedingungen aus? Hängt es vom Taxon ab, von der DNA-Konzentration, von den Primern oder irgendetwas anderem?
Sie müssen zuerst ein erstes Protokoll erstellen und es dann optimieren.
Das Wichtigste zur Bestimmung der Bedingungen ist die verwendete Polymerase. Einige Polymerasen arbeiten bei höheren oder niedrigeren Temperaturen und arbeiten schneller oder langsamer. Finden Sie das Standardprotokoll vom Polymerase-Verkäufer und dies gibt Ihnen eine gute Vorstellung davon, wo Sie anfangen sollen.
Das zweitwichtigste sind die verwendeten Primer. Abhängig vom GC-Prozentsatz in den Primern und ihrer Länge ändern sich die Zeiten oder die Temperatur jedes Schritts oder müssen optimiert werden, wenn Sie dies bevorzugen . Die Länge der DNA-Fragmente bestimmt auch die Länge der Zyklen. Die meisten Polymerase-Verkäufer enthalten Schritte zur Optimierung der Reaktion in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Menge, Primerlänge und anderen Parametern.
Für mehr Informationen:
Beispiel für ein Taq-DNA-Polymerase-Protokoll:
Verwenden Sie primer3, um Ihre Primer zu entwerfen, und verwenden Sie dann einfach das Protokoll, das Ihr Labor normalerweise für die PCR verwendet.
Eine hohe Glühtemperatur löst viele Probleme, und ein ausreichend guter Taq wird nichts dagegen haben.
Ich habe Tausende und Abertausende von Säugetier-Exons erfolgreich sangersequenziert, mit von Primer3 entworfenen Primern, einem HotStar Taq und einer Annealing-Temperatur von 60 Grad. Hat fast immer funktioniert.
Wenn Sie eine lange PCR durchführen oder mit sehr hohen GC- oder niedrigen GC-Spezies arbeiten, erfordert dies offensichtlich mehr Optimierung.
Nach meiner Kenntnis sollte die Annealing-Temperatur in PCR-Primern hauptsächlich so gewählt werden, dass sie 5° niedriger als die untere Schmelztemperatur von Primern gehalten wird. Zweitens spielt die MgCl2-Arbeitskonzentration auch eine große Rolle bei der PCR-Optimierung
vkehayas