Ich versuche, eine NGS-Bibliothek auf angereicherter DNA aufzubauen (DNA-Länge = 93 bp). Ich verwende PCR-Amplifikation mit zwei überhängenden Primern, die beide Illumina-Adaptersequenzen enthalten (Universal Adapter & TruSeq Adapter mit Barcode). Meine endgültige Bibliothek sollte (~ 182 bp) sein:
Universaladapter (-), angereicherte DNA (+), TruSeq-Adapter (=)
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Nach PCR-Amplifikation und QC per Gel sehe ich größere Fragmente. Die Analyse durch Bioanalyzer weist darauf hin, dass ich möglicherweise eine Polymerisation des TruSeq-Adapters in der Bibliothek erhalte. Dies ist höchstwahrscheinlich auf ein schlechtes Primer-Design zurückzuführen, da der Primer zwei Erkennungssequenzen (21-nt) enthält, eine am 3'-Ende und eine am 5'-Ende des TruSeq-Adapters
Meine Frage ist:
Wie würde die NGS-Analyse beeinträchtigt, wenn eine Bibliothek zur Sequenzierung eingereicht wird, die eine Mischung aus einzelnen und doppelten TruSeq-Adaptern enthält?
Einzel:
Universaladapter (-), angereicherte DNA (+), TruSeq-Adapter (=)
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Doppelt:
Universaladapter (-), angereicherte DNA (+), TruSeq-Adapter 1 (=), TruSeq-Adapter 2 (=)
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Würden die Sequenzierungsinformationen aus der "doppelten Bibliothek" verloren gehen oder würden diese Fragmente problemlos gelesen?
Danke,
Kurz gesagt, aufgrund der Länge der Fragmente, die Sie sequenzieren, laufen Sie Gefahr, Informationen aus Ihrer Bibliothek zu verlieren.
Wenn Sie Ihren Sequenzierungslauf einrichten, legen Sie den Parameter für die Anzahl der Sequenzierungszyklen fest, die die Länge der zu sequenzierenden Reads bestimmen. Je länger die in Ihrer Bibliothek enthaltenen Fragmente sind, desto weniger werden sie vollständig sequenziert.
Eine gute Idee wäre, Ihre vermuteten polymerisierten Fragmente zu sequenzieren, um zu überprüfen, ob die Primer-Polymerisation wirklich stattfindet. Senden Sie einfach Ihre Probe zur normalen Sequenzierung, wie Sie es für Plasmide und PCR-Fragmente tun würden.
Wenn Ihre Primer aufgrund eines ineffizienten Designs polymerisieren, sollten Sie dies beheben, bevor Sie Ihre Bibliothek in das Illumina-Gerät laden. Wenn der Primer-Dimer-Effekt einen erheblichen Teil Ihrer Bibliothek ausmacht, wird dies nur während des Laufs verstärkt und kann definitiv zu einer deutlich weniger komplexen Bibliothek führen. Das Sequenzieren einer Bibliothek mit geringer Komplexität ist ein wirklich kostspieliger Fehler, dessen einziges garantiertes Ergebnis darin besteht, Ihren Berater zu verärgern und ihn dazu zu bringen, Ihre Kompetenz lautstark in Frage zu stellen. Vertrau mir.
Wald