Entwerfen Sie beliebige degenerierte Primer (mit unverbindlichen Kriterien)

Ich möchte eine Reihe beliebiger degenerierter Primer (Primer mit variablen Basen, zB NGATWGCTSATNGC) für eine TAIL-PCR entwerfen .

Ich möchte die folgenden Parameter für die Designfunktion angeben können:

  • Glühtemperatur (ideal 44°C)
  • Degeneration (wie viele Variationen des AD-Primers gibt es (idealerweise 128 oder 256)
  • Bindungshäufigkeit am (Maus-)Genom (idealerweise 1/3000) – obwohl dies von der Degeneration abhängen kann und umgekehrt.
  • Nicht bindender Bereich (natürlich möchte ich nicht, dass eine Variation des Primers an den Bereich mit bekannter Sequenz zwischen meinen spezifischen Primern und dem unbekannten Bereich, den ich sequenzieren möchte, bindet)

Irgendwelche Ideen für Tools, die mir bei den obigen Schritten helfen können? Für das Primer-Design habe ich bisher eprimer3 verwendet (mit ausnahmslos zufriedenstellenden Ergebnissen) - aber es scheint das Konzept willkürlicher degenerierter Primer nicht zu unterstützen.

Wenn ich eine Funktion hätte, die das erste der oben genannten Kriterien aussortieren könnte, könnte ich im Idealfall Biopython und BLAST verwenden, um den Rest selbst zu skripten. Obwohl die Bindungshäufigkeit Stunden, wenn nicht ein oder zwei Tage dauern würde, bis BLAST sie bestimmt hat. Es wäre sehr hilfreich, wenn jemand bereits etwas Ausführlicheres dazu geschrieben hätte.

Kennen Sie die gewünschte Reihenfolge? Ich meine, die degenerierten Orte sind markiert, Naber der Rest ist vorhanden. Ich kenne kein Programm, das das kann. Aber ich kann Ihnen einen Arbeitsablauf vorschlagen, der einfache Skripte und vorhandene Bioinformatik-Tools verwendet.
los, vorschlagen! Was die Frage betrifft, nein, die Reihenfolge selbst ist für mich völlig irrelevant. Was mir wichtig ist, sind die oben genannten Kriterien. Jede Sequenz, die sie erfüllt, wäre für meine Zwecke geeignet.
Zum 4. Punkt: Ich gehe davon aus, dass die genauen Zündhütchen genauso lang sind wie die degenerierten. Wollen Sie Primer mit variabler Länge? Das wird komplizierter.
Mit dem "exakten" Primer meinen Sie den/die spezifischen Primer für die TAILPCR? Wenn ja, nein, sie sind ~ 20 bp, die AD-Primer sollten ungefähr ~ 14 bp haben (obwohl ich denke, dass dies ein wenig variiert werden kann, um die Bindungsfrequenz und die Annealing-Temperatur zu berücksichtigen).

Antworten (1)

Wenn Sie bereits die Grundsequenz kennen, dh die festgelegten Regionen im Primer; B. für die bekannten Nukleotide in der Sequenz - NGATWGCTSATNGC, dann können Sie Ihren Algorithmus wie folgt implementieren:

  • Legen Sie die maximale Länge der Primer fest. Sagen wir 20nt.
  • Generieren Sie alle Kombinationen von Primern (20nt): das ist ziemlich einfach. Sie haben
    4 N × 2 (R+Y+S+W+K+M) × 3 (B+D+V+H) Kombinationen, wobei jedes Alphabet die Anzahl solcher Instanzen bezeichnet. Suchen Sie auf dieser Seite nach den Nukleotidcodes.
  • Berechnen Sie die Tm der Primer-Template-Paare. UNAfold hat einen Nukleotid-Hybridisierungs-Tm-Rechner. Sie können Parameter wie Salzkonzentration usw. angeben. Es gibt auch andere solche Tools. Diese können auf der Kommandozeile ausgeführt werden.
  • Verwerfen Sie alle Primer, deren Tm unter der akzeptablen Grenze liegt.
  • Für diejenigen, die die akzeptable Tm überschreiten, lassen Sie eine Base von 3' fallen, bis die Tm innerhalb des Bereichs liegt.
  • Wenn die Primerlänge unter 14 nt sinkt, entsorgen Sie den Primer.
  • Überprüfen Sie nun mit all diesen ausgewählten Primern auf Parameter wie Selbsthybridisierung, GC-Clamp usw. (OPTIONAL). Sie können primer3 für diese Zwecke verwenden, indem Sie es im primer_checkModus ausführen.
  • Laden Sie die nr/ntBLAST-Datenbank herunter.
  • Passen Sie die BLAST-Parameter für die Suche nach kurzen Nukleotiden an: Verringern Sie die Wortlänge, erhöhen Sie den E-Wert-Cutoff usw. (Siehe diesen Biostar-Beitrag und die BLAST-Hilfe ).
  • BLAST deine Zündhütchen gegen die Datenbank im plus-minusModus.
  • Sorgen Sie sich nur um Fälle, in denen eine signifikante Ausrichtung am 3' des Primers vorliegt, da nur diese eine Verlängerung verursachen können.

Diese Anweisungen können mit jeder Sprache oder jedem Shell-Skript automatisiert werden.

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