Wie gestaltet man interne Primer?

Ich habe Sequenzen der Cytochrom-c-Oxidase I (COI) aus mehreren Populationen von Peringia ulvae (Mollusca; Gastropoda; Littorinimorpha; Hydrobiidae). Ich benötige zusätzliche COI-Sequenzen aus einer bestimmten Population. Wenn ich die gleichen Primer und das gleiche PCR-Protokoll wie für die anderen Populationen verwende, erhalte ich kein PCR-Produkt für die spezifische Population. Mein PI schlug mir vor, interne COI-Primer für Peringia ulvae zu entwerfen . Wie kann ich das machen? Soll ich die COI-Sequenzen der anderen Populationen verwenden?

Sie könnten versuchen, einfach eine degenerierte Version der Primer zu bestellen, die Sie haben. Wenn möglich, versuchen Sie, die Sequenzen für viele bekannte COI-Allele Ihres Organismus abzugleichen, und sehen Sie, welche Basen besonders variantenreich sind. Wenn die Sequenz konserviert ist, behalten Sie diese Base bei, wenn sie variabel ist, fügen Sie Ihrer Primer-Reihenfolge ein degeneriertes/zufälliges Nukleotid hinzu. Die Primermischung, die Sie zurückerhalten, enthält dann jede mögliche Variante für eine bestimmte Position, und das könnte Ihnen helfen, eine Amplifikation zu erhalten.
Versuchen Sie, die Annealing-Temperatur Ihrer PCR zu senken. Wenn es nur wenige Fehlpaarungen zwischen den DNA-Sequenzen der verschiedenen Populationen gibt, können Sie sie möglicherweise alle mit demselben Primer-Set amplifizieren, indem Sie Ihr Annealing weniger stringent machen. Eine Frage: Annealing der Primer innerhalb der codierenden Sequenz von COI oder in der flankierenden Region?
@alec_djinn Wie kann ich wissen, wo die Primer glühen?
@JustineVandendorpe kennst du die Sequenz der Primer? Wenn ja, dann verwenden Sie einfach BLAST, um zu verstehen, wo sie glühen.
@alec_djinn Ich kenne die Sequenzen und habe einen BLAST ausgeführt. Vielen Dank!

Antworten (1)

Wenn Sie keine Amplifikation erhalten, müssen Sie mehrere Dinge überprüfen, bevor Sie interne Primer entwerfen möchten. Sie sollten versuchen, Ihre PCR-Reaktionen zu beheben, bevor Sie interne Primer entwerfen und bestellen. Wenn Sie die PCRs falsch durchführen, werden Sie wahrscheinlich wieder auf die gleichen Probleme mit internen Primern stoßen.

Es gibt ausgezeichnete Leitfäden zur Fehlerbehebung bei PCRs - Nur eine Google-Suche nach „Fehlerbehebung bei PCRs“ sollte Ihnen eine Menge Material liefern, das Sie durchgehen können. Dies ist von NEB , aber es gibt mehrere andere, wobei jeder Hersteller seine eigenen hat, sodass Sie sich auf eines der Reagenzien beziehen können, die Sie verwenden.

Primer liefern im Allgemeinen gute Lesevorgänge vom 5'-Ende für etwa 600-700 bp und danach verschlechtert sich die Qualität des Basenaufrufs. Wenn Ihr Ziel-Amplikon also über 1500 bp liegt, benötigen Sie interne Primer, da die "externen" Primer nachgeben würden Sie gute Sequenzen für nur etwa 1400 bp (600–700 bp aus beiden Richtungen, für fwd- und rev-Primer). Daher können interne Primer verwendet werden, um die Regionen zu sequenzieren, die von den (externen) Vorwärts- und Rückwärtsprimern nicht erreicht werden können. Die veröffentlichten Artikel, in denen Sie die externen Primer verwenden, werden höchstwahrscheinlich die internen Primer enthalten, wenn CO1 lang genug ist, um interne Primer zu erfordern.

Andernfalls müssten Sie die vorhandenen Sequenzen aus den anderen Populationen abgleichen und konservierte Regionen des Abgleichs durchsuchen, die als potenzielle Priming-Sites fungieren könnten. Es gibt noch andere Dinge zu erledigen, bevor Sie eine „konservierte Region“ als „Priming-Site“ betrachten und Primer bestellen können. Auch hier gibt es hervorragende Anleitungen zum Grundierungsdesign, die nur eine Google-Suche entfernt sind.

Lassen Sie mich wissen, wenn Teile der Antwort nicht klar sind oder wie Fachjargon klingen, und ich werde mein Bestes tun, um sie für Sie zu vereinfachen. Ich würde jedoch dringend vorschlagen, zuerst eine Fehlersuche bei der PCR durchzuführen - zum Beispiel, indem Sie eine Gradienten-PCR ausprobieren, um die optimale Annealing-Temperatur zu finden.

Ich danke Ihnen sehr für Ihre Antwort. Ich verwende auch die Reagenzien von NEB, also habe ich mir ihren Tm-Rechner angesehen. Bei den eingegebenen Parametern erhielt ich eine Warnmeldung mit der Aufschrift: "Tm-Differenz ist größer als der empfohlene Grenzwert von 5 °C." Wisst ihr wie ich das lösen kann?
Hallo, was ist die Annealing-Temperatur, die Sie in Ihrer PCR verwenden, und wie hoch ist die Tm für Ihre Primer? Haben Sie auch so etwas wie Nanodrop-Messwerte Ihrer DNA-Proben? Kennen Sie ihre Konzentration? Wenn die Konzentrationen zu hoch/zu niedrig sind, werden PCRs gehemmt.
Ich verwende eine Glühtemperatur von 52 °C. Die für meine Vorwärts- und Rückwärtsprimer vorgeschlagene Tm beträgt 49 °C bzw. 59 °C. Die DNA-Konzentration meiner Proben reicht von 0 bis 870 ng/µl.
870 ist VIEL zu hoch. Im Allgemeinen werden 25-100 ng DNA im Reaktionsgemisch empfohlen.
Wie gestaltet man interne Primer?
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