Gegeben sei die Sequenz: 5'-ACTGACTATGTAGAA………GGCCCTAAGGGCCAA-3' (1)
Sie möchten eine PCR dieser dsDNA durchführen, um „Überhänge“ an den Enden hinzuzufügen. Am 5'-Ende wird die Restriktionsstelle für das NdeI-Enzym (5'-CATATG) platziert. Am 3'-Ende setzen Sie die Restriktionsstelle für MspI (5'-CCGG).
Schreiben Sie dazu die Sequenzen für die „Forward“- und „Reverse“-Primer. Jeder Primer sollte 16-18 nt lang sein, mit 12 nt für die Hybridisierung und 4-6 nt für den „Überhang“.
Ich bin ein wenig verwirrt darüber, wie ich die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die Sequenz schreiben soll. Aus Videos habe ich gesehen, dass ich den komplementären Strang meines gebenden Strangs schreiben sollte. Welches sein würde:
3' -TGACTGATACATCTT........CCGGGATTCCCGGTT-5' (2)
Dann sollte ich aus Sequenz (1) den Reverse-Primer und aus Sequenz (2) den Forward-Primer erhalten. Dies erlaubt mir jedoch nicht, beide Restriktionsenzyme hinzuzufügen, da beide Primer von 5' bis 3' liegen würden.
Oder sollte ich einfach die gegebene Sequenz nehmen und die Primer nur daraus schreiben? Damit wären die Primer:
Vorwärts-Primer: 3'- GGCC TGACTGATACAT
Umgekehrte Grundierung: GGATTCCCGGTT GTATAC - 5'
wobei die fettgedruckten nts die Restriktionsstellen sind.
Danke schön!
Wie in den obigen Kommentaren angedeutet, denken Sie daran, dass Sie doppelsträngige DNA amplifizieren, also sollten zwei neue revers-komplementäre Stränge aus jedem Zyklus erzeugt werden (damit sie miteinander hybridisieren können). Wie in Ihrer Antwort geschrieben, würden beide Primer mit Ihrem gegebenen Strang hybridisieren, und die Amplikons würden sich nicht überlappen (einer bindet an jedem Ende, aber beide würden in die gleiche Richtung amplifizieren).
Um dies zu beheben, benötigen Sie einen Primer, der an die Zielsequenz bindet, und einen, der an den Reverse-Complement-Strang bindet, den Sie bereits generiert haben. Die neuen Amplikons verlängern 5' -> 3' (vom 3'-Ende des Primers, nicht der Matrize ), sodass Ihre Primer am 3'-Ende ihres jeweiligen Strangs binden müssen. Dieser Link hat eine gute Visualisierung davon.
Das 3'-Ende des Primers muss eng mit der Matrize hybridisieren, da hier die Verlängerung stattfindet (wird in diesem Leitfaden besprochen ). Ihre flankierenden Restriktionsstellensequenzen befinden sich also immer am 5'-Ende eines der beiden Primer (beachten Sie, dass die Frage tatsächlich darauf hinweist, indem sie das 5'-Ende jeder Flanke angibt).
Der Primer, der als Ihr "umgekehrter" Primer angegeben ist, bindet tatsächlich an das 3'-Ende Ihrer gegebenen Sequenz in der entsprechenden Ausrichtung, aber Sie möchten vielleicht Ihre 3'-Flanke auf das 5'-Ende dieser Primersequenz legen, da dies der Fall sein wird theoretisch das 3'-Ende Ihres Amplikons sein. Ihr anderer Primer muss das 3'-Ende Ihres reversen Komplements (das das 5'-Ende Ihres Ziels ist) binden, damit er die 5'-Flanke der Restriktionsstelle hat.
Konventionell werden Primersequenzen immer im 5'---3'-Format angegeben. Stellen Sie also sicher, dass Ihre Antwort dieser Konvention folgt. (dh 5'- Flank -Primer-3').
Wenn das alles wirklich verwirrend klingt, dann deshalb, weil es so ist. Ich mache das beruflich und überprüfe meine Primer immer noch zweimal in einem Programm wie Primer3
Maximilian Presse
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