Problem bei der DNA-Sequenzierung

Lassen Sie mich zunächst mit der Schilderung des Problems beginnen:

Ihr Labor hat eine Technik zur Untersuchung der DNA-Replikation in einem Zellextrakt entwickelt. Zu dem zellulären Proteinextrakt fügen Sie Nukleotide, eine kleine Menge radioaktiv markiertes 32P-dGTP hinzu, um die Visualisierung der synthetisierten DNA zu unterstützen, und ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül mit 4000 Basenpaaren, das in der Mitte einen Replikationsursprung enthält. Nachdem Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 30 °C ablaufen lassen, kochen Sie die Mischung, um die Proteine ​​und die DNA-Stränge zu denaturieren, trennen die Komponenten auf einem Acrylamidgel und detektieren die radioaktiv markierten DNA-Produkte. Diese vollständige Reaktion ist in Bahn 2 auf dem Gel in der Abbildung unten gezeigt.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Problem A:

Sie führen den Assay zum ersten Mal selbst durch, ohne dass jemand anderes im Labor ist. Das Röhrchen mit der Aufschrift „Nukleotidmischung“ reicht nur für eine einzige Reaktion, aber Sie finden ein Röhrchen mit der Aufschrift „dATP, dTTP, dGTP, dCTP“ und verwenden dieses in einer zweiten Reaktion. Sie sehen, dass die erste Reaktion wie Bahn 2 und die zweite Reaktion wie Bahn 3 aussieht. Warum wurde in der zweiten Reaktion keine DNA synthetisiert?

Meine Antwort:

Weil Desoxyribosetriphosphate keine -OH-Gruppe zum Anhängen haben. Mit denen kann man eigentlich nicht bauen.

Problem B:

Ihr Laborpartner hat kürzlich einen Mutantenstamm isoliert, der seine DNA bei 30 °C normal replizieren kann, aber bei 40 °C keine DNA-Replikation zeigt. Er nennt die Mutante tsr1, für Temperature Sensitive Replication. Der Wildtyp-Stamm repliziert effizient bei beiden Temperaturen. Sie glauben, dass Sie mit dem biochemischen Test von Zellextrakten feststellen können, welche Gene in der Mutante defekt sind. Sie züchten Wildtyp-Zellen und tsr1-Zellen bei 40 °C, stellen die Extrakte her, inkubieren die DNA-Replikationsreaktion bei 40 °C und detektieren die Produkte auf einem Gel. Sie beobachten das in den Spuren 4 und 5 gezeigte Muster. Sie sind von den Ergebnissen so begeistert, dass Sie zu Ihrem Laborpartner rennen und ihm sagen, dass Sie wissen, welches Enzym defekt ist. Er freut sich über Ihre Ergebnisse, sagt aber, dass es drei verschiedene Enzyme gibt, die für Ihre Ergebnisse verantwortlich sein können. Was sind Sie?

Ich bin zu 100% auf diesem verloren.

Ich verstehe aus der Abbildung, dass der Wildtyp bei 40 Grad 4000 Nukleotide hat, also wird er nicht abgeschnitten. Die Mutante trs1 wird in zwei Scheiben von 2000 geschnitten und eine dieser Scheiben wurde in Scheiben von 500 geschnitten? Verstehe ich das richtig? Ich verstehe auch nicht, warum die 500er Linie im Vergleich zu den anderen so dick ist?

Jedenfalls fühle ich mich diesbezüglich sehr verwirrt. Ich habe etwas über die Sanger-Sequenzierung gelernt und es macht 100% Sinn, wenn ddXTP dem Mix hinzugefügt wird, um die Länge jeder Sequenz anzuzeigen und daher die Sequenz lesen zu können, aber ich bin mir nicht einmal sicher, ob das hier passiert.

Der Titel der Frage ist etwas irreführend, da das Problem / die Frage, die Sie detailliert haben, nicht wirklich ein Sequenzierungsproblem ist

Antworten (1)

Auch wenn Du - bzw. das Problem nicht geklärt hast, gehe ich in meiner Antwort davon aus, dass Du mit Eukaryoten-System arbeitest, obwohl das Prinzip der Replikation das gleiche ist.

dNTPs haben eine OH-Gruppe an ihrem 3. Kohlenstoffatom (siehe zB diese Wiki-Seite für dCTP), also denke ich nicht, dass das hier das Problem ist. Meine Vermutung ist, dass das erste Röhrchen das radioaktiv markierte GTP enthält und das zweite nicht, also ist selbst die DNA da, man kann es nicht sehen - obwohl die Frage speziell gestellt wurde, warum keine DNA synthetisiert wurde, ist es meiner Meinung nach eine knifflige Frage dich zu verwirren.

Für das zweite Problem müssen wir uns ein wenig mit dem Replikationsprozess befassen:

In der Replikationsgabel werden die beiden Stränge unterschiedlich synthetisiert. Der sogenannte führende Strang wird kontinuierlich ohne Unterbrechungen hergestellt, der andere Strang, der sogenannte nachlaufende Strang, wird jedoch durch Ligieren kleiner Fragmente - auch bekannt als Okazaki-Fragmente - synthetisiert. Diese kleinen Fragmente erfordern ihre eigenen RNA-Primer, die nach der Synthese entfernt werden müssen. Da der Replikationsursprung in der Mitte liegt und die Replikation in beide Richtungen erfolgen kann, können Sie bei einem linearen Fragment wie Ihrem zwei 2000-bp-Fragmente aus den beiden führenden Strängen erhalten. Wäre es eine zirkuläre DNA, könnten Sie immer noch 4kbp-Fragmente erhalten, da die Replikation um den DNA-Kreis herumgehen könnte. Die kleineren 500 bp-Fragmente, die in der tsr1-Spur reichlich vorhanden sind, sind die Fragmente, die nicht ligiert werden können. Davon abgesehen muss ich zugeben, dass 500 bp Okazaki-Fragmente für Eukaryoten untypisch wären (üblich sind etwa 100-200 bp). Die dafür verantwortlichen Enzyme könnten also sein:

DNA-Ligase – diejenige, die für das Ligieren (Verbinden) der Fragmente des nacheilenden Strangs verantwortlich ist. Polymerase delta (Pol δ): Das ist für die Verzögerungsstrangsynthese und Primerentfernung verantwortlich – in diesem Fall könnte die Primerentfernungsfunktion defekt sein, dies führt dazu, dass die Primer auf der DNA verbleiben und eine vollständige Synthese und Ligation nicht stattfinden kann. Das letzte Protein, obwohl es kein Enzym ist, ist der DNA-Klammerkomplex (PCNA). Dieser Komplex stabilisiert die Polymerase gegenüber DNA, aber wenn ein vorheriges Fragment erreicht wird, sollte die Polymerase dissoziieren. Wenn die Klemme jedoch nicht funktioniert, bleibt die Polymerase am Ende des Fragments hängen, sodass keine Primerentfernung und Ligation stattfinden kann.

Wenn Sie weitere Informationen benötigen, lesen Sie diese Wiki-Seite .

Sie müssen kein eukaryotisches System annehmen. Das Prinzip ist auch für Prokaryoten dasselbe (die Okazaki-Fragmente sind in Prokaryoten länger, wenn auch ~2000nt).
Ja, so ist es. Es wurde nur angegeben, um meine Logik in der Antwort anzuzeigen. Abgesehen davon könnten die 2-kb-Fragmente leicht Okazaki-Fragmente eines prokaryotischen Systems sein, aber was ist dann mit den 500-bp-Fragmenten? Außerdem müssen Sie, wenn explizite Enzyme für die Antwort erforderlich sind, wissen, welches System der Assay verwendet. Ich werde meine Antwort bearbeiten, um darauf hinzuweisen, dass das Prinzip für Eukaryoten und Prokaryoten gleich ist.
Problem bei der DNA-Sequenzierung
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