Multiplex-PCR, kürzeres Amplikon hemmt längeres Amplikon?

Ich möchte Multiplex-PCRs für meine Genotypisierung durchführen, mit einem Primerpaar, das auf mein Konstrukt abzielt, und einem Primerpaar, das auf ein Haushaltsgen abzielt (eine Art eingebaute Kontrolle).

Ich habe das Kontroll-Amplikon so entworfen, dass es sehr kurz ist (ich habe 3 Primerpaare mit ~120, 85 bzw. ~50 bp Amplikons getestet). Der Hauptgrund dafür ist, dass meine Amplikons normalerweise ~ 200-400 bp sind und ich etwas klar Unterscheidbares haben möchte, aber eher kürzer als länger (ich möchte meine Optionen für längere Ziel-Amplikons offen halten).

Unabhängig davon, welches Kontrollprimerpaar ich verwende, sehe ich auf jeden Fall immer dann, wenn ich versuche, zu multiplexen, nur das kürzere Amplikon. Siehe das Gelbild unten für ein Beispiel (Spuren: 1-Leiter, 2,3-Ziel + Kontrolle, 4,5-Kontrolle, 5,6-Ziel).

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Ich sehe, dass die Bahnen 2,3 im Vergleich zu 4,5 einen sehr schwachen zusätzlichen Abstrich aufweisen, aber ich möchte eine Bande für mein Ziel-Amplikon. Außerdem sind meine kürzeren Bänder ziemlich verschwommen.

Nur als Referenz, meine Amplikons überlappen sich überhaupt nicht.

Also, ich denke, meine Fragen sind:

  • Warum verschwindet das längere Band?
  • Warum ist das kürzere Band so verschwommen?
  • Was kann ich tun, um dieses Formular zu verhindern?
Wie weit sind das Konstrukt und das Housekeeping-Gen voneinander entfernt? Wenn sie nahe beieinander liegen, kann es zu Transkriptionsstörungen kommen.
Solange sich die Amplicons nicht überlappen, sehe ich keine direkte Interferenz. In jedem Fall überlappen sie sich nicht und befinden sich auf unterschiedlichen Chromosomen.
Eine Überlappung ist nicht erforderlich, damit eine Transkriptionsinterferenz auftritt, aber da sich Ihre Gene auf verschiedenen Chromosomen befinden, sollte dies nicht der Fall sein. Hat dieses Setup schon einmal funktioniert oder ist dies die erste Verwendung dieses Primer-Sets?
Was sind die T m dieser Primerpaare? Wenn ein Primerpaar bei einer bestimmten Temperatur deutlich stabiler ist, könnte dies Ihre Ergebnisse erklären.
58-60°C für alle Grundierungen. Alle 3 PCRs werden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt – würden Sie sagen, dass es keine Polymerase mehr gibt, die von den weniger stabilen Primern rekrutiert werden könnte?
50bp-Amplikon ist keine gute Idee. Sie sehen aus wie Primer-Dimere.
Richtig, ich denke, das kann problematisch werden, wenn ich jemals dimerisierende Primer verwende. Dennoch tritt das gleiche Problem bei 120 und 85 bp auf. Tatsächlich ist die Zahl, die Sie hier sehen, 85 bp

Antworten (1)

Es stellt sich heraus, dass die T m In der Tat war das Problem, oder besser gesagt, dass der Berechnungsalgorithmus das überschätzte T m des Primerpaares für das längere Amplikon (bzw. das des kürzeren unterschätzt). Auf jeden Fall scheint es, dass bei 60°C die kürzeren Amplicon-Primer den Polymerisationsmechanismus kapern.

Das Einstellen der Glühphasentemperatur auf 55 ° C hat mein Problem gelöst, und jetzt erhalte ich durchweg bessere Ergebnisse:

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