Doppel-PCR mit Tailed Primer

Ich möchte eine Doppel-PCR mit Universal-Tailed-Primer durchführen. Die erste PCR würde ein mit Schwänzen versehenes Amplicon erzeugen. Die zweite PCR würde ein mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Fragment erzeugen. Hier ist mein Protokoll. Können Sie mir sagen, ob ich falsch liege?

  • Ist mein zweiter PCR-Vorwärts-Primer so konzipiert, dass er zum Schwanz passt?
  • Wie wäre das Verhältnis der zu verwendenden Primer, wenn ich die beiden PCR zu einer zusammenführen möchte?

Faust-PCR (funktioniert)

Fett gedruckt haben Sie den Schwanz M13 (-20)

Vorwärts: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT TCTGCAGTTGTACTGAGTGAA-3'
Rückwärts: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

  • Wasser = 15,8 ul
  • MgCl2 (25 mM) = 18 µl
  • Puffer (5x) = 6 ul
  • dNTP (4 mM) = 1,5 μl
  • Vorwärts (20pmol/µL) = 1µL
  • Umgekehrt (20pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5 U/µl) = 0,15 µl
  • DNA (50 ng/µl) = 1 µl

Zweite PCR ( funktioniert nicht = kein Fragmentsignal )

Vorwärts: 5'-[FAM]- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
Rückwärts: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

  • Wasser = 15,8 ul
  • MgCl2 (25 mM) = 18 µl
  • Puffer (5x) = 6 ul
  • dNTP (4 mM) = 1,5 μl
  • Vorwärts (20pmol/µL) = 1µL
  • Umgekehrt (20pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5 U/µl) = 0,15 µl
  • DNA (50ng/µL) = 1µL von meinem vorherigen Amplikon
Sind Sie gezwungen, die Umkehrung so zu verwenden? Mir wurde beigebracht, A/T-Enden und Dehnungen von mehr als 3 aufeinanderfolgenden C/Gs oder A/Ts zu vermeiden; Ihre Rückseite hat beides. Haben Sie außerdem einen Gradienten für die Glühtemperatur ausprobiert?
Nein, ich kann die Grundierung wechseln! Danke für deinen Rat.

Antworten (1)

Ich bin mir nicht sicher, ob ich Ihre Anfrage verstehe. Ich kann sagen, dass wir in meinem Labor auch fluoreszierende Farbstoffe (für die SSR-Erkennung) verwenden. Aber wir tun es mit einem einstufigen Ansatz:

Unsere Forward-Primer sind wie Ihre mit vorangestellter Fluo-Sequenz (M13-Forward-Primer). Aber anstatt eine zweite PCR durchzuführen, fügen wir direkt den Fluo-Primer (nennen wir ihn M13-FAM) in die erste PCR ein. Es ist WIRKLICH wichtig, Ihren M13-Vorwärtsprimer in einer geringeren Menge als den Rückwärtsprimer zu platzieren (Faktor 10 für mich). Um das zu erreichen, verwende ich 0,1 mM Primerlösungen und mische meine Primer vorher

Für 96 Vertiefungen (20 µL/Vertiefung)

Primer-Mix

  • 1,25 ul M13-F-Primer
  • 12,5 ul R-Primer
  • 240 ul Wasser

PCR-Mix

  • 200 µL Primer-Mischung
  • 20 ul M13-FAM
  • Master-Mix 1 ml
  • Wasser 1ml
Danke ! Du beantwortest meine Frage perfekt! Ich habe 2 PCRs durchgeführt, um zuerst meine Primer zu überprüfen. Aber mein letztes Ziel ist, was du getan hast. Könntest du mir deine Primer geben? Um zu überprüfen, ob ich nicht falsch liege? Ich bin mir nicht sicher, ob M13-Tail-Primer und M13-FAM in der gleichen Orientierung 5'-3' sein müssen
Doppel-PCR mit Tailed Primer
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