Ich habe Schwierigkeiten, in der mir zur Verfügung stehenden Literatur eine Erklärung dafür zu finden, wie die Einzelprimer-Amplifikation von DNA funktioniert. Kann jemand die Methodik erklären und was sie bewirkt?
Dieser Vorgang wird als sequenzunabhängige Einzelprimer-Amplifikation (oder kurz SISPA) bezeichnet. Es wird verwendet, um unbekannte Sequenzen für die Amplifikation zu amplifizieren, beispielsweise in unbekannten Viren. Die für dieses Verfahren verwendeten Primer enthalten Zufallssequenzen, die an die zu amplifizierende DNA binden sollen, sowie bekannte Sequenzen, die als Adaptoren verwendet werden können. In den ersten PCR-Runden führen nur die zufälligen Primer zu spezifischen Produkten, die in den späteren PCR-Runden exponentiell amplifiziert werden, da die Primer dann perfekt passen. Dies wird ausführlich in dieser Veröffentlichung beschrieben: „ Random Priming PCR Strategy to Amplify and Clon Trace Quantitys of DNA “
Die Einzelprimer-Amplifikation wird verwendet, um unbekannte DNA-Regionen zu finden, wenn Sie keine Ahnung haben, was Sie weiter stromaufwärts als Primer verwenden sollen. Es funktioniert auf der Idee, dass jede Grundierung bei einer bestimmten Temperatur falsch grundiert wird. Dass es an einem nicht bestimmten Ort geglüht wird. Es handelt sich also um eine PCR, aber bei dieser Temperatur bindet der Primer der fünf Prime-Regionen spezifisch an seine bekannte Stelle. An den drei Primzahlen bis zu 3500 Basen entfernt ermöglicht die niedrige Anlagerungstemperatur diesem spezifischen Primer, an etwas zu binden, das seiner komplementären Sequenz ähnelt, aber nicht genau. Auf diese Weise erhalten Sie immer noch eine erfolgreiche PCR-Reaktion. Wenn die Zyklen fortgesetzt werden, bindet das 3'-Ende spezifisch an Ihren einen Primer und Sie können die Temperatur erhöhen, um ihn spezifischer zu machen. Das Primerdesign und die Temperaturen müssen sehr sorgfältig abgewogen werden.
Quellen