Warum wird für die DNA-Sequenzierung nur ein statt zwei Primer verwendet?
Okay
Ich verstehe, dass die PCR zwei Primer verwendet, die sich an die beiden ssDNAs anlagern, um eine DNA exponentiell zu amplifizieren, und dass die Sanger-Sequenzierung nur einen Primer verwendet, da eine Sequenz mit nur einem Primer und einem Einzelstrang mit ddNTPs bestimmt werden kann. Allerdings habe ich das hier gelesen:
"Die Sequenzierung verwendet einen Primer, während die PCR zwei verwendet. Wenn wir versuchen, mit zwei vorhandenen Primern zu sequenzieren, erhalten Sie die beiden Sequenzen zurück, überlagert und völlig unlesbar."
Ich habe Mühe, mir vorzustellen, warum die Verwendung von zwei ein Problem darstellen würde. Wie wird die DNA dadurch unlesbar?
Vielen Dank im Voraus!
Antworten (1)
Chris
Die Reaktion für die Sanger-Sequenzierungsreaktion enthält neben dem normalen dNTP (das zur Herstellung des größten Teils der DNA benötigt wird) die Didesoxynukleotide, denen die 3'-OH-Gruppe fehlt und die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Sobald eines dieser Nukleotide eingebaut ist, stoppt die Kettenreaktion hier und führt zu einem Produkt mit einer bestimmten Länge und einer (durch den Fluoreszenzfarbstoff) bekannten Endbase.
Theoretisch führt dies zu Produkten einer Länge von Primer + 1 ddNTP-Base, Primer + 1 Base + 1 ddNTP-Base, Primer + 2 Basen + 1 ddNTP-Base und so weiter. Der Sequenzierer trennt diese Basen nach Größe und liest sequentiell den Fluoreszenzfarbstoff aus und übersetzt diesen in eine Basensequenz. Siehe das Bild aus der Wikipedia zur Veranschaulichung:
Wenn Sie jetzt zwei Primer hinzufügen (und natürlich eine doppelsträngige DNA haben), beginnt diese Reaktion an beiden Enden der DNA (immer in 5'--> 3'-Richtung), was zu zwei Sätzen markierter DNA gleicher Größe führt (also wieder die Basis + 1 ddNTP, Basis + 1 Basis + 1 ddNTP und so weiter). Da diese gleich groß sind, werden Sie immer zwei Basen gleichzeitig auslesen und nicht erkennen können, welches Signal zu welchem Strang gehört. Das sieht (ab hier) so aus :
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