Umgang mit repetitiven Basen in der DNA?

Ich habe ein Projekt erhalten, das ein Plasmid beinhaltet, das lange Abschnitte von Adenin enthält (jeweils 60 oder 120 Basen). Diese PolyA-Dehnungen werden gelegentlich durch G oder C unterbrochen.

Ich verstehe, dass die Durchführung von PCR, Klonierung, DNA-Synthese, Mutagenese und Sequenzierung an repetitiven Sequenzen schwierig ist. Welche Techniken und Praktiken sollte ich befolgen, um die Genauigkeit beim Umgang mit diesen PolyA-Sequenzen zu verbessern?

Was genau versuchen Sie mit diesem Plasmid (genauer gesagt diesem PolyA-Schwanz) zu tun? Müssen Sie es verstärken, verdauen usw.? Abhängig davon können verschiedene Strategien implementiert werden, um Fehler mit dem PolyA-Schwanz zu minimieren
@AdamRadekMartinez Nehmen wir an, ich wollte diese unterbrechenden Gs durch ein A ersetzen. Wie funktioniert die ortsgerichtete Mutagenese, wenn Sie mehr als 1 potenzielle Stelle haben? Wie sequenzieren Sie die DNA, um zu überprüfen, ob die Mutation funktioniert hat?

Antworten (2)

Sie können viel längere Primer (bis zu 70 bp oder so) verwenden, sodass sie die repetitive Region, die Sie ändern möchten, und eine spezifischere Sequenz zum Verankern des Primers umfassen (vorausgesetzt, Ihr Vektor lässt dies zu). Wenn die mehreren Stellen, die Sie ändern möchten, in Reichweite zueinander liegen, können Sie Primer mit 2 oder mehr mutagenisierten Stellen bestellen – Sie müssen jedoch damit rechnen, dass Ihre Effizienz nachlässt. Ihre andere Möglichkeit wäre, mehrere Mutageneserunden durchzuführen und jeweils eine Position zu ändern.

Ich würde diese Primer dann einfach auf einer Gradienten-PCR mit einem guten Enzym wie Q5 von NEB ausprobieren. Der Versuch, eine Temperatur für das richtige Größenband zu finden, wird wahrscheinlich der Schlüssel sein.

Das wirkliche Problem, das Sie haben werden, ist wahrscheinlich nicht das Klonen, es wird es beweisen. Homopolymer-Strecken sind ein echtes Problem für die Sequenzierung, und je länger sie werden, desto schlimmer wird es. Automatisierte Sequenzierer finden es schwierig, beispielsweise zwischen 29 Adeninen und 30 Adeninen in Folge zu unterscheiden. Wenn Ihre Sequenzierungsergebnisse zurückgegeben werden und Ihre Sequenzierung um ein oder zwei Basen daneben liegt, ist es ziemlich unmöglich zu sagen, ob Ihre Sequenzierung oder Ihr Konstrukt falsch war.

Okay, eines der Hauptprobleme mit polA-Schwänzen ist die PCR, eine Methode, die üblicherweise beim molekularen Klonen, bei der spezifizierten Mutagenese usw. verwendet wird.

Ein Problem mit PolyA-Schwänzen und PCR sind die Primer. Da A nur 2 statt 3 Wasserstoffbrückenbindungen haben, kann dies die Entwicklung guter Primer in diesem Bereich erschweren. Wenn Sie diese Region mit PCR amplifizieren möchten, haben Sie möglicherweise Probleme beim Entwerfen von Primern, da empfohlen wird, dass Sie viele G und Cs haben (besonders in der Nähe der Enden für Stabilität). Daher wird das Erstellen von stumpfen Enden, Mutagenese usw. schwieriger.

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