Quantifizierung von DNA in einer Bande bei der Gelelektrophorese

Ich bin ein Student im ersten Jahr der Naturwissenschaften und stelle dies nur als eher theoretische Frage und nicht zur Durchführung eines Protokolls. Daher würde ich es begrüßen, wenn die Antworten nicht viele komplizierte chemische Namen beinhalten.

Ich habe mich gefragt, wie man die DNA-Menge in einer bestimmten Bande bei einer Gelelektrophorese quantifizieren würde. Einige Ideen, die ich bisher hatte, sind:

  • Schneiden Sie die DNA-Bande aus und extrahieren Sie die DNA. Quantifizieren Sie unter Verwendung eines bekannten Verfahrens, wie z. B. Messen der Extinktion bei 260 nm der DNA in Lösung, um die Konzentration zu finden.
  • Wenn die DNA mit Ethidiumbromid gefärbt wird, wird im Allgemeinen eindeutig mehr Farbstoff in einer Bandenregion aufgenommen, wenn sie mehr DNA enthält, so dass sie mit größerer Intensität fluoresziert, wenn sie mit UV-Licht beleuchtet wird. Allerdings hätte ich Vorbehalte gegen die Verwendung dieser Methode, weil ich denken würde, dass die aufgenommene Farbstoffmenge auch vom Zustand der DNA abhängen würde (dh ob sie supercoiled ist oder nicht), aber andererseits weiß ich nicht, wie stark sie sich auswirkt Dies könnte davon abhängen, wie viel Fleck aufgenommen wird. Wenn Sie natürlich wissen, dass sich Ihre gesamte DNA im selben Zustand befindet, sollte es mit dieser Methode meiner Meinung nach kein Problem geben. Obwohl man sich hier bewusst sein müsste, dass die Konzentration von Ethidiumbromid in einer bestimmten Bande von der dortigen Nukleotidkonzentration abhängt, die sowohl von der Anzahl der DNA-Fragmente als auch von ihrer Größe (die aus der Position der Bande bekannt ist) abhängt. Vergleichen Sie dies mit der endgültigen Methode ...
  • Schließlich, wenn man die DNA zum Beispiel unter Verwendung von Didesoxy-Kettenabbruch/Sanger-Sequenzierung in PCR herstellt, dann kann man einen radioaktiv markierten Primer verwenden. Die Intensität des Bildes auf dem Radioautogramm würde Ihnen dann direkt die Anzahl der Moleküle dieses DNA-Fragments sagen, die in der Bande vorhanden sind.

Ich habe mich gefragt, welche davon praktikable Optionen für die Verwendung im Labor sind und warum/warum nicht.

Antworten (1)

Alle drei Methoden könnten verwendet werden, um die DNA-Menge zu messen. In der Praxis funktioniert jedoch Methode 2 (Schätzung anhand der Farbstoffhelligkeit) normalerweise am besten in einem normalen Arbeitsablauf. Es hängt wirklich davon ab, was Sie als nachgelagerte Anwendung vorhaben.

Probleme mit Methode 1:

  • Die Ausbeute von Gel-Reinigungsmethoden ist manchmal pingelig und anfällig für Verluste.
  • Die Absorption von verbleibender Agarose kann die Ergebnisse beeinflussen. DNA-Reinigung ist ein Muss.

Probleme mit Methode 2:

  • Die Quantifizierung ist schwierig, da Sie die Bandhelligkeit gegen einen bekannten Standard abschätzen müssen (fügen Sie eine bekannte Größe Ihrer Leiter hinzu und verwenden Sie diese zur Schätzung).
  • Durch Supercoiling von Plasmiden erscheinen mehrere Banden, daher muss die Schätzung mehrmals durchgeführt und dann hinzugefügt werden (jetzt ist es weniger eine Schätzung als vielmehr eine Vermutung).

Probleme mit Methode 3:

  • Die Arbeit mit Radioaktivität fügt einem einfachen Verfahren eine erhebliche Menge an Sicherheitsprotokollen hinzu
  • Alle Produkte aus der radioaktiven Markierung müssen ebenfalls als radioaktives Material behandelt werden
  • Die Verwendung eines Bildes hat das gleiche Problem wie Methode 2, bei der Sie schätzen, anstatt tatsächlich zu quantifizieren.
  • Mit einem Szintillationszähler könnten Sie quantitativere Ergebnisse erzielen, aber dann werden die Produkte aufgrund der Reinigung aus der Szintillationsflüssigkeit schwieriger zu verwenden (möglicherweise ist dies möglich, aber ich habe es nie versucht).
  • Sie sind auf Verfahren beschränkt, die die radioaktiv markierten Nukleotide enthalten würden
  • Wenn Sie so etwas wie dA-Tailing machen, dann quantifizieren Sie nicht die DNA-Menge, sondern die Anzahl der Kopien eines Transkripts.
Quantifizierung von DNA in einer Bande bei der Gelelektrophorese
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v