Trennung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese. Sind alle Stränge für eine Größe gleich?

Die Antwort auf den Teil Ihrer Frage, der sich mit der durchschnittlichen Länge von Restriktionsfragmenten befasst, lautet: Wenn das zu verdauende DNA-Molekül eine zufällige Sequenz hat und 50% GC / 50% AT ist, dann ist die Wahrscheinlichkeit, eine bestimmte kurze Sequenz an jeder Position zu finden ist 1/4 ^N , wobei N die Länge der kurzen Sequenz ist. So beträgt beispielsweise für ein Restriktionsenzym mit einer 4-Basen-Erkennungssequenz wie AluI (AGCT) die Wahrscheinlichkeit 1/256 und somit wäre die durchschnittliche Länge eines AluI-Fragments 256 bp. Für ein Enzym mit einer 6-Basen-Erkennungssequenz wie HindIII (AAGCTT) beträgt die entsprechende Zahl 4096 bp. Bitte beachten Sie, dass dies die durchschnittliche Länge und keine "erwartete" Länge ist.

Die Antwort auf den Teil Ihrer Frage zu Fragmenten gleicher Größe, die gemeinsam migrieren, wie würden Sie sie zur weiteren Analyse auf einem Gel reinigen, ist schwieriger. Ich denke, das erste, was zu sagen ist, ist, dass Sie dies nicht für die Sequenzierung tun würden, und dies spiegelt sich in den verschiedenen Antworten wider, die Sie bereits erhalten haben - die Sequenzierung erfordert diese Art von Ansatz nicht mehr.

Wenn Sie aus irgendeinem Grund in diese Position gezwungen wurden, können mir zwei Dinge einfallen, die helfen könnten: Die erste Option wäre, die Analyse auf einem Acrylamidgel durchzuführen, wenn Sie eine viel bessere Auflösung verschiedener Fragmente erzielen können (alle 50-bp-Fragmente sind nicht das gleiche Molekulargewicht), aber das ist wirklich nur nützlich für kleine Fragmente (100 bp oder weniger). Der wahrscheinlichste Ausweg aus dem Co-Migrationsproblem wäre jedoch, die beiden mitwandernden Fragmente als Gemisch zu reinigen und sie dann in einen Vektor zu ligieren, woraufhin jede Rekombinante das eine oder andere der beiden Fragmente tragen würde. Dies geht wirklich auf den ursprünglichen Grund zurück, warum das molekulare Klonen die Dinge revolutioniert hat – es ermöglicht die „biologische“ Reinigung von DNA-Fragmenten, gefolgt von der Produktion dieser Fragmente in großen Mengen.

Sie erwähnen „ spezielle Basenpaare, denen eine Hydroxylgruppe fehlt “, so deutlich, dass Sie an Sanger-(Didesoxy-)Sequenzierung denken, in welchem ​​Fall Sie direkt in einen M13-Phagenvektor klonieren könnten, um ssDNA für die direkte Sequenzierung herzustellen. Durch Sequenzieren einer Reihe von Klonen würden Sie zwei Sequenzen finden, eine für jedes Fragment. Sie müssten jedoch immer noch einen Weg finden, um zu entscheiden, welches das Fragment ist, an dem Sie tatsächlich interessiert sind.

Wie ich schon sagte, die Dinge werden einfach nicht mehr auf diese Weise gemacht.

Sie haben Recht: Stränge gleicher Länge haben nicht unbedingt die gleiche Sequenz. Die Trennung von DNA in der Gelelektrophorese basiert rein auf der hydrodynamischen Größe.

Die Anzahl der durch den Restriktionsenzymverdau produzierten Fragmente hängt von der Anzahl der Stellen für dieses bestimmte Enzym in Ihrer Eingabe-DNA ab. Restriktionsenzyme schneiden nur an bestimmten Nukleotidsequenzen. Aus diesem Grund gibt es keine "typische Länge" des erzeugten Fragments.

Die Idee, DNA auf der Grundlage eines RE-Verdaus zu trennen, besteht darin, dass eine Mutation, die die Sequenz ändert, an der das RE bindet und schneidet , die Anzahl der Fragmente verringert, da das RE an dieser Stelle nicht mehr binden und schneiden kann: 2 kleinere Fragmente tun es jetzt erscheinen als ein großes Fragment. Aufgrund der unterschiedlichen Anzahl und Größe der Fragmente ist dies auf dem Gel sichtbar.

Wenn Sie ein Gel laufen lassen, verwenden Sie normalerweise DNA, die selektiv amplifiziert wurde, um die Anzeige auf eine bestimmte (bekannte) Region des Chromosoms auszurichten. Dieser elektrophoretische Ansatz funktioniert, weil Sie nicht alle 46 Chromosomen gleichzeitig betrachten.

Was die Sequenzierung betrifft, würde ich empfehlen, mit Wikipedia zu beginnen . Sequenzierungstechniken ändern sich ziemlich schnell, daher gibt es keine gute Quelle, die mir bekannt ist. Zunächst können Sie sich über die Sanger-Sequenzierungsmethode informieren. Wenn Sie PCR verstehen, werden Sie es nicht schwer finden zu verstehen.

Soweit ich weiß, sind Sie verwirrt, wie man sicher sein kann, dass eine Bande in einem Gel die gesuchte Sequenz ist, da Sequenzen unterschiedlich sein können und dennoch dieselbe Länge haben (z. B. ACTTAT hat dieselbe Länge wie GGCCGT, ist jedoch völlig unterschiedlich ). Ihre eigentliche Frage könnte also eher so lauten wie "Wie stellt man fest, dass ein Gelband nur die gesuchte Sequenz enthält?"

Es ist richtig, dass die Beschränkung einer langen Sequenz in der Praxis zu ähnlich langen Abschnitten führen kann, die nicht dieselbe Sequenz sind. Es ist tatsächlich möglich, aus dem Gel, das die Bande enthält, ein kleines Quadrat auszuschneiden und dann das Gel aufzulösen und das genetische Material zu extrahieren. Wenn Sie das Ergebnis sequenzieren, erhalten Sie eines von zwei Ergebnissen: 1) Wenn das Band nur Ihre gewünschte Sequenz enthält, sollte Ihre Sequenzierungstechnik genau diese Sequenz als Ergebnis wiedergeben. 2) Wenn das Band mehr als eine unterschiedliche Sequenz derselben Länge enthielt, wird Ihre Sequenzierungsmethode wahrscheinlich zweideutige Ergebnisse hinterlassen.

Die Sequenzierung würde also wahrscheinlich nur bestätigen, ob die Bande eine einzelne unterschiedliche Sequenz enthielt oder nicht. Es wäre nicht nützlich, um die gewünschte Sequenz für zukünftige Experimente von einer anderen Sequenz derselben Länge zu trennen. Eine Methode dafür könnte die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) sein, ein Verfahren, das eine große Anzahl (Milliarden) von Kopien einer bestimmten Zielsequenz produziert. Wenn eine PCR zur Amplifikation der in der Gelbande enthaltenen Zielsequenz durchgeführt würde, würden alle anderen Sequenzen gleicher Länge keine Kopien erzeugen. Sie wären immer noch vorhanden, aber da sie der für Ihre Experimente relevanten Sequenz zahlenmäßig weit unterlegen sind, sollten die anderen Sequenzen keine signifikanten Auswirkungen haben.

Wie dd3 jedoch feststellte, würden Sie normalerweise nicht das Ergebnis einer Restriktion auf einem Gel ausführen und dann versuchen, Ihre Zielsequenz vom Rest zu trennen. Stattdessen würden Sie einfach die oben beschriebene PCR-Methode direkt nach der Verwendung der Restriktionsenzyme verwenden und das Ergebnis dann auf einem Gel laufen lassen. Sie würden dann ein sehr starkes Band für die gesuchte Sequenz erhalten und viel schwächere Bänder für alles andere.