Wie wirkt sich die Größe des Inserts auf die Rate der homologen Rekombination in Hefe aus?

Wenn genetische Knockouts in Hefe unter Verwendung von homologer Rekombination durchgeführt werden, um eine Zielgensequenz über eine Vektor-DNA zu ersetzen, muss die Region zwischen den flankierenden Regionen im Vektor dieselbe Länge haben wie die Rekombinationsstelle im Gen der Wirtszelle?

Wenn ich das richtig verstehe, fragt Adelina, ob die DNA zwischen den flankierenden Regionen (dh dem Insert, das integriert wird) dieselbe Länge haben muss wie das Gen, das ausgeknockt wird. Die Antwort ist nein.

Antworten (2)

Wie von aandreev betont, ist die Rekombinationsrate umso geringer, je größer die Größe des Einsatzes im Verhältnis zu den Flanken ist. Dies liegt daran, dass die Spender-DNA im Wesentlichen nicht-homolog wird. Siehe die folgenden Abbildungen:

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Abbildung 1: Auswirkung der Insertgröße auf die Rekombinationseffizienz. Kunget al. (2013) Appl Environ Microbiol. Mar;79(5):1712-7

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Abbildung 2: Auswirkung der Flankengröße auf die Rekombinationseffizienz. Kunget al. (2013) Appl Environ Microbiol. Mar;79(5):1712-7

Sie haben jedoch erwähnt, dass Sie Gen-Knockouts machen wollen. In diesem Fall müssen Sie nur eine kleine Mutation vornehmen (z. B. ein vorzeitiges Stopcodon einführen).

Die Verwendung von Genom-Editing-Tools wie Crispr-Cas, ZFN und TALEN erhöht die Transgeneserate durch Einführung von DNA-Doppelstrangbrüchen.

Diese können auch für Knockouts verwendet werden, wenn NHEJ als DNA-Reparaturmechanismus über HR dominiert. NHEJ ist fehleranfällig und kann Indels verursachen, die die Genfunktion stören können.

Beeindruckend. Schön recherchierte Arbeit. +1
Die erste Figur ist sehr schön. Außerdem werde ich sie alle verwenden, um später im Labor zu argumentieren.

Meiner Ansicht nach besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Rekombinationswahrscheinlichkeit und der Größe des Inserts. Kleinere Wendeschneidplatten mit größeren Flanken lassen sich leichter einarbeiten. Das verstehe ich aus der Überprüfung von Studien, die auf dem Cas9/CRISPRs-System basieren. Dasselbe sollte für HR-Mutagenese in Hefe stehen.

Also, kurze Antwort wird sein: kürzere Einsätze sind effizienter. Ich konnte jedoch keine Studien zum Zusammenhang zwischen der Rekombinationseffizienz und der Verwendung kleinerer als der Zieleinsätze oder zum Zusammenhang zwischen der Größe des Ziels und des Einsatzes finden. Das Cas9/CRISPR-System wurde verwendet , um die loxP-Stelle (34nt) anstelle von ~10 bp in Mäuse-ES-Zellen einzufügen. Die Menschen versuchen normalerweise, GFP oder etwas ähnliches anstelle kürzerer genomischer Sequenzen einzufügen.

Wie wirkt sich die Größe des Inserts auf die Rate der homologen Rekombination in Hefe aus?
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