Restriktionskartierung der Plasmidzuordnung

pUWL22 ist ein kreisförmiges, doppelsträngiges Plasmid von 10,5 kb. Es enthält ein Gen, das für ein Enzym kodiert, das dem Wirtsbakterium Ampicillin-Resistenz verleiht. Das Klonieren in die kpnI- und SstI-Stellen hebt die Ampicillinresistenz auf, wohingegen das Klonieren in andere Stellen auf dem Plasmid dies nicht tut. Der Verdau mit den folgenden Restriktionsenzymen einzeln und in Kombination führt zu folgenden Daten:

Enzyme Digest     ()()()()()()   Fragments Produced (kb)

Hind III  ___________________________10.5

Kpn I  _______________________________10.5

Not I  _______________________________10.5

Pvu II  ______________________________10.5

Sst I  _______________________________10.5

Stu I  _______________________________10.5

Hind III + Kpn II  ___________________8.5  _______________2.0

Hind III + Not I _________________8.0  __________________2.5

Hind III + Pvu II ________________6.0  __________________4.5

Hind III + Sst I _________________7.5  __________________3.0

Hind III + Stu I _________________7.5  __________________3.0

Stu I + Not I  ____________________10.0  __________________0.5

Stu I + Pvu II  ____________________7.5  __________________3.0

Nun die eigentlichen Fragen:

A) Erstellen Sie eine kreisförmige Karte von pUWL22, indem Sie die Hind III-Stelle als Position 0 auf der Karte bezeichnen. Wenn Sie die Karte fertiggestellt haben, geben Sie die relative Position des Ampicillin-Gens an.

Mein Plasmid-Mapping:Mein Plasmid-Mapping

Wobei ich Hilfe brauche, um die relative Position des Ampicillin-Gens anzugeben. In der obigen Erklärung hieß es: "Das Klonen in die Kpn I- und Sst I-Stellen hebt die Ampicillin-Resistenz auf." Bedeutet das, dass es zwischen Sst 7,5 und Kpn 8,5 liegt? Bitte sagen Sie mir, wo es ist und warum es dort ist.

PS Ich habe einen Fehler beim Sst I-Enzym gemacht, es ist vermutlich @ 7,5 und nicht 7,8.

Die Frage danach lautet:

B) Schlagen Sie 2 weitere doppelte Digests vor, die zur Bestätigung Ihrer Analyse durchgeführt werden könnten. Prognostizieren Sie die Größe der Fragmente, die aus diesen Digests generiert würden.

Bitte beantworten Sie diese und erklären Sie warum.

Bitte beachten Sie, dass Sie viel bessere Antworten auf Ihre Frage erhalten, wenn Sie erklären, was Sie bisher versucht haben, oder Ihre Lösung angeben und fragen, ob sie richtig ist. Außerdem schadet es nie, zumindest einige Formatierungen in Ihre Frage aufzunehmen, anstatt nur einen Textblock. Willkommen auf der Seite, egal xD
Ich habe das Diagramm gezeichnet, das war nicht selbstverständlich, ich stecke bei dem Teil fest, der die relative Position des Ampicillin-Gens und Frage B anzeigt.
Ich habe versucht, es so gut wie möglich zu gestalten, danke, dass du es schöner gemacht hast

Antworten (2)

A) Hier ist die richtige Karte:Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Sie haben einen Fehler auf Ihrer Karte an der PvuII-Site gemacht (sie befindet sich nicht auf 6,5 kB vom Start des Plasmids, sondern auf 6 kB).

Kann das Kpn I nicht auf die 8.5-Site gehen, es erstellt immer noch die 2 und 8.5, also gibt es nicht mehr als 1 richtige Option für die Plasmidkarte?

Ja. Um die richtige Karte zu erstellen, müssen Sie alle möglichen Positionen der Restriktionsstellen ausprobieren:

  1. Sie beginnen mit HindIII und platzieren es an Position 0 Ihres Vektors.
  2. Die KpnII-Stelle kann entweder bei 2 kb (links von HindIII) oder bei 8,5 kb (rechts von HindIII) liegen. Zeichnen Sie beide Versionen des Plasmids.
  3. Sie platzieren die NotI-Site, die entweder 2,5 KB oder 8 KB groß sein kann. Nun haben Sie vier verschiedene Möglichkeiten für das Plasmid:
    1. HindIII[0], KpnII 2 , NotI[2.5]
    2. HindIII[0], KpnII[8.5], NotI[2.5]
    3. HindIII[0], KpnII 2 , NotI[8]
    4. HindII[0], KpnII[8.5], NotI[8]
  4. Dann machen Sie dasselbe für die restlichen Restriktionsstellen. Wenn Sie zu den letzten beiden Digests gelangen, gibt es nur noch eine Option für das richtige Plasmid in der folgenden Reihenfolge, die auf der Plasmidkarte unten dargestellt ist.

Ich muss jedoch darauf hinweisen, dass StuI und SstI beide 3kb groß sein können (sie können nebeneinander liegen). Dann sind die 2 Fragmente aus dem Digest ~3kB und ~7,5kB groß. Technisch gesehen gibt es also zwei mögliche Versionen: richtig

a) HindIII[0], KpnII 2 , NotI[2.5], StuI[3], PvuII[6], SstI[7.5]

b) HindIII[0], KpnII 2 , NotI[2.5], StuI[3], SstI[3] PvuII[6]

Wenn Sie können, können Sie bitte auf Frage b näher eingehen, warum es eine richtige Option für die Plasmidkarte gibt? Und was meinen sie mit doppeltem Verdau, um Ihre Analyse zu bestätigen?

Ein doppelter Verdau bedeutet, dass Sie Ihr Plasmid gleichzeitig mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen schneiden. Da Sie bereits eine mutmaßliche Karte des Plasmids haben, können Sie vorhersagen, welche Banden erwartet werden. Wenn Sie die erwarteten Größen einhalten, ist Ihr Design korrekt und Ihre Analyse bestätigt.

Um zu überprüfen, welches richtig ist, würde ich einen doppelten Digest durchführen mit: 1) SstI und PvuII, wobei ein 1,5-kb- und ein 9-kb-Band erzeugt wird, wenn Design a) korrekt ist, oder ein 3-kb- und ein 7,5-kb-Band, wenn Design b) korrekt ist. 2) StuI und SstI, wobei ein 4,5-kb- und ein 6-kb-Band erzeugt werden, wenn Design a) korrekt ist, oder ein 10,5-kB-Band, wenn Design b) korrekt ist

Um zu bestätigen, dass das "Ampicillin-Gen" bei kpn I 2.0 beginnt und bei der 3.0 stu I-Site endet, richtig? Das Amp-Gen ist also 1 kB lang?? Die relative Position des Amp-Gens beginnt also bei 2,0 und endet bei 3,0. Warum heißt es in der Frage, dass das Klonen in die kpn I- und sst I-Stellen die Ampicillinresistenz aufhebt, während das Klonen an anderen Stellen dies nicht tut? Was meinen sie damit? Unterscheidet sich das Ampicillin-Resistenzgen vom Ampicillin-Gen??

Das Ampicillin-Resistenzgen und das Ampicillin-Gen sind gleich. Es bezieht sich auf ein Enzym (Beta-Lactamase), das Ampicillin abbaut, und somit können die Zellen, die das Ampicillin-enthaltende Plasmid beherbergen, überleben, wenn sie auf Ampicillin plattiert werden.

Sind Sie sicher, dass die Resistenz gestört wird, wenn in die SstI-Stelle und nicht in StuI geklont wird? Wenn dies wirklich der Fall ist, dann liegen die StuI-Site und die SstI-Sites nebeneinander, da zuerst die SstI-Site und dann die StuI-Site vorhanden sind. Das amp-Gen Das Gen ist etwas größer als 1 kb, also beginnt es stromaufwärts von KpnII und endet direkt nach SstI, aber es stört StuI nicht. Wenn etwas in KpnII- oder SstI-Stellen kloniert wird, wird der offene Leserahmen von amp zerstört und das Protein kann nicht funktionsfähig sein.

Hier ist die Lösung

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Ich habe 1 Punkt abgezogen für die Position von Not I

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