Als Team von Bachelor-Forschern wollen wir zwei interessierende Gene in unsere kompetenten E.coli-Zellen transformieren. Diese beiden Gene befinden sich in getrennten Plasmiden und wir möchten sie in eine E.coli-Zelle einbringen. Kann eine Zelle in einem Transformationsprozess zwei Plasmide aufnehmen? Wenn die letzte Frage unmöglich ist, ist es möglich, eine Zelle zu transformieren und dann die durch diese Transformation erzeugten Kolonien zu transformieren? Vielen Dank.
Die beiden Plasmide müssen unterschiedliche Replikationsursprünge haben. Zwei Plasmide aus derselben Inkompatibilitätsgruppe können nicht zusammen in derselben Zelle überleben.
Dieses Zitat stammt aus dem Wikipedia- Eintrag zu Plasmiden:
Plasmide können auch in Inkompatibilitätsgruppen eingeteilt werden. Eine Mikrobe kann verschiedene Arten von Plasmiden beherbergen, jedoch können verschiedene Plasmide nur dann in einer einzigen Bakterienzelle existieren, wenn sie kompatibel sind. Wenn zwei Plasmide nicht kompatibel sind, geht das eine oder andere schnell aus der Zelle verloren. Unterschiedliche Plasmide können daher unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen zugeordnet werden, je nachdem, ob sie zusammen koexistieren können. Inkompatible Plasmide teilen normalerweise die gleichen Replikations- oder Partitionsmechanismen.
Dies ist eine schöne Definition/Erklärung aus einem OpenAccess- Artikel :
Ein formales Schema der Plasmidklassifizierung basiert auf Inkompatibilitätsgruppen (Inc) (Novick, 1987). Das Verfahren zur Inkompatibilitätsgruppierung basiert auf der Einführung durch Konjugation oder Transformation eines Plasmids einer "unbekannten" Inc-Gruppe in einen Stamm, der ein Plasmid einer bekannten Inc-Gruppe trägt. Wenn das residente Plasmid in der Nachkommenschaft eliminiert wird, wird das ankommende Plasmid derselben Inc-Gruppe zugeordnet (Datta und Hedges, 1971). Plasmide mit derselben Replikationskontrolle sind "inkompatibel", während Plasmide mit unterschiedlichen Replikationskontrollen "kompatibel" sind. Auf dieser Grundlage können zwei Plasmide, die zur gleichen Inc-Gruppe gehören, nicht in der gleichen Zellinie vermehrt werden (Datta und Hughes, 1983; Couturier et al., 1988). Die Identifizierung von Inc-Gruppen wurde häufig verwendet, um Plasmide zu klassifizieren.
Eine Zusammenfassung des oben genannten Artikels von Datta & Hedges:
Klassifikation 1971 schlugen Hedges und Datta ein Plasmid-Klassifikationsschema vor, das auf der Stabilität von Plasmiden während der Konjugation (Inkompatibilität) basiert. Die ersten Inkompatibilitätsgruppen (Inc) waren IncI, IncN, IncF und IncP. Derzeit werden 26 Inc-Gruppen in Enterobacteriaceae erkannt, darunter sechs IncF- (FII bis VII) und drei IncI-Varianten (I1, Iγ, I2). In Enterobacteriaceae vorkommende Hauptplasmidfamilien sind HI2, HI1, I1-γ, X, L/M, N, FIA, FIB, FIC, W, Y, P, A/C, T, K, B/O, FII, FIII , FIV. IncF-Plasmide sind Plasmide mit geringer Kopienzahl, die oft mehr als ein Replikon tragen, wobei mindestens ein Replikon stark konserviert ist.
Eine Möglichkeit, darüber nachzudenken, ist: wenn man einen Plasmid-Klonierungsvektor herstellt, um fremde Inserts zu akzeptieren, und eine "Schrotflinten"-Sammlung von Fragmenten von irgendeiner interessierenden DNA ligiert. Nach Transformation, Selektion und Wachstum auf Platten enthält keine der Kolonien, deren Plasmide Inserts tragen, jemals mehr als ein einzigartiges Plasmid. Mit anderen Worten, es kann möglich sein, dass zwei verschiedene Inserts während der Ligation in dasselbe Vektorrückgrat eingefügt werden, aber es ist nicht möglich, eine einzige reine Kolonie zu finden, die Zellen enthält, die zwei verschiedene Plasmide beherbergen, die jeweils ein anderes Insert tragen.
Wenn eine Zelle von zwei verschiedenen Plasmiden aus derselben Inc- Gruppe transformiert wird, wird nur ein Plasmid "gewinnen".
Beispiele für häufig anzutreffende kompatible ori :
Hier ist eine schöne Tabelle , aber ich kann nicht für ihre Genauigkeit bürgen.
Die doppelte Transformation (Sie können versuchen, mit diesem Begriff zu suchen) ist seit sehr langer Zeit machbar , aber die Effizienz ist natürlich geringer als bei jeder einzelnen Transformation unterhalb des Sättigungspunkts.
Zu Ihrer zweiten Frage: Wenn die Zellen kompetent gemacht werden, sollte eine sequentielle Transformation meiner Meinung nach funktionieren.
Chris
Kelly Eckartt
März Ho