Ich war darüber im Unterricht immer verwirrt und habe es nie vollständig gelernt. Angenommen, Sie haben 10.000 bp DNA und möchten nur 100 bp einer bestimmten Region (Gen von Interesse) mit einem Restriktionsenzym isolieren.
Wie können Sie sicherstellen, dass an beiden Enden Ihres interessierenden Gens die richtigen Sequenzen für bestimmte zu schneidende Restriktionsenzyme vorhanden sind?
Unter der Annahme, dass Sie genau wissen, wo sich das interessierende Gen im gesamten DNA-Strang befindet, ist es ziemlich einfach, das Gen zu isolieren. Es gibt mehrere Restriktionsenzyme, die Sie verwenden können , es ist nur eine Frage der Bestimmung, welche für Ihr interessierendes Gen am besten geeignet sind.
Denken Sie daran, dass es normalerweise in Ordnung ist, zusätzliche Nukleotide an beiden Enden des Gens zu haben; Die Ribosomen beginnen und stoppen das Hinzufügen von Peptiden basierend auf Start- und Stoppcodons, unabhängig davon, wie weit sich das Ribosom bewegt, bevor es das Startcodon erreicht. Analysieren Sie Ihren DNA-Strang und versuchen Sie, ein Restriktionsenzym zu finden, das den Strang irgendwo schneidet, bevor das Gen beginnt, und normalerweise ein anderes, das ihn irgendwo nach seinem Ende schneidet, obwohl manchmal dasselbe Enzym für beide Enden des Gens funktioniert.
Bearbeiten: Wie @Untitpoi erwähnt hat, wird Ihr Gen in zwei (oder mehr) Teile geschnitten, wenn die Slice-Sequenz des Restriktionsenzyms innerhalb des interessierenden Gens gefunden wird. Es ist sehr wichtig sicherzustellen, dass das/die von Ihnen gewählte(n) Enzym(e) das interessierende Gen nicht zerschneidet, da der Strang sonst unbrauchbar wird. Es ist möglich, die Stränge wieder zusammenzufügen (was dank klebriger Enden nicht allzu schwierig ist), aber warum sich die Mühe machen, wenn es nicht nötig ist?
Sie müssen etwas über die gewünschte Sequenz und die flankierende Sequenz wissen, dann wählen Sie ein Restriktionsenzym aus, das ungefähr dort schneidet, wo Sie möchten. Es gibt so viele verschiedene Enzyme mit unterschiedlichen Schnittzielsequenzen, dass es normalerweise möglich ist, ein geeignetes zu finden.
der Forstökologe