Wenn Bakterien mit rekombinanten DNA-Molekülen beim Klonen von Genen nicht überleben, wie können sie nach der Isolierung zu einer Kolonie gezüchtet werden?

Soweit geht mein Verständnis von Genklonen. Nehmen wir an, das Plasimd (Vektor) in den Bakterien enthält ein Ampicillin-Resistenzgen. Durch Restriktionsenzyme wird das Ampicillin-Resistenzgen durchtrennt und fremde DNA eingefügt. Dadurch entsteht ein rekombinantes DNA-Molekül.

Sobald viele Bakterien in ein Medium eingeführt werden, das Ampicillin enthält, überleben nur diejenigen, die keine rekombinante DNA und funktionelle Ampicillin-Resistenzgene haben, und diejenigen mit rekombinanter DNA nicht. Durch die Zugabe einiger Chemikalien werden die überlebenden Bakterien blau und diejenigen mit der rekombinanten DNA werden weiß. So können Bakterien mit rekombinanter DNA entnommen und in ihrer eigenen Kultur gezüchtet werden, die rekombinante DNA kann isoliert werden und die Forschung geht weiter.

Wenn jedoch alle Bakterien mit rekombinanter DNA abgetötet wurden, weil sie keine funktionellen Ampicillin-Resistenzgene haben, wie können sie dann in ihrer eigenen Kolonie „gezüchtet“ werden? Sie sind alle schon tot, nicht wahr?

Dieses Thema wurde in früheren Fragen behandelt, z. B. biology.stackexchange.com/questions/69141/… .
Sie verwechseln zu viele Dinge: 1) Das Ampicilin-Gen wird normalerweise nicht herausgeschnitten, um rekombinante DNA herzustellen. Stattdessen 2) wird das Schneiden/Einfügen in einen Vektor gewöhnlich an einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) unabhängig vom Resistenzgen durchgeführt. 3) Das Blau/Weiß-Screening verwendet ein Beta-Lactamase-Gen und ist ebenfalls nicht mit Ampicilin verwandt.
@Nicolai ja, ich habe gemerkt, wie schlecht es war, und meine eigene Frage beantwortet. Ich hätte die Frage gelöscht, weil sie so verwirrend war, konnte es aber nicht, weil sie bereits eine Antwort hatte.

Antworten (2)

Die Frage bringt zu viele Dinge durcheinander. Das beschriebene Verfahren, Lac Z Blue-White Screening , beinhaltet weder das Schneiden des Ampicillin-Gens, noch sterben die Bakterien mit der rekombinanten DNA oder ohne die rekombinante DNA im Verlauf des Experiments.

Das Plasmid enthält ein Lac Z-Gen, das an der Bildung von Enzymen beteiligt ist, die Galaktose abbauen. In einem Reagenzglas nehmen die Vektorplasmide das interessierende Gen auf und die rekombinante DNA wird produziert. Die rekombinante DNA wird dann dem Bakterienmedium zugesetzt, aber nur ein Teil der Bakterien wird transformiert und nimmt den Plasmidvektor auf. In diesen Bakterien „schneiden“ Restriktionsenzyme einen Platz zum Einfügen in das Lac Z-Gen auf, und DNA-Ligase versiegelt ihn. Die Insertion des Gens in ein Bakterium stört das Lac Z-Gen und macht es unfähig, die erforderlichen Enzyme zum Abbau von Galactose zu produzieren. Dann werden die Bakterien auf eine Petrischale aufgetragen, die Wachstumsmedien mit einem Galactose-Derivat, X-Gal, darin enthält. Wenn X-Gal von den Bakterien abgebaut wird, die in der Lage sind, die notwendigen Enzyme aus ihren funktionellen Lac Z-Genen zu erzeugen, Die Bakterienkolonie wird blau. Wenn Sie also diese Bakterien in die Petrischale geben, nur die Bakterienohne rekombinante DNA wird X-Gal abgebaut und blau, während Bakterien mit rekombinanter DNA es nicht abbauen können und weiß bleiben. Dies ermöglicht es dem Forscher, zwischen Bakterien mit und ohne rekombinante DNA zu unterscheiden und diejenigen mit dieser zu isolieren.

Ich habe meine eigene Frage beantwortet, weil ich in der Zeit, seit ich sie gestellt habe, gelernt habe, wie schlecht es war.
Ihre Beschreibung, wie die Blau-Weiß-Färbung funktioniert, ist (im Wesentlichen) richtig, die Erzeugung rekombinanter DNA findet jedoch nicht in Bakterien statt. Rekombinante Plasmide werden von Forschern in vitro (d. h. in einem Reagenzglas) unter Verwendung von Restriktionsenzymen (und eher wie DNA-Ligase) erzeugt. Beachten Sie, dass in den meisten Fällen sogar ein Plasmid, das das interessierende Gen nicht erhalten hat, immer noch rekombinant wäre , da selbst das verwendete Basisplasmid normalerweise nicht in dieser Form in den verwendeten Bakterien gefunden wird.
@Nicolai Ich habe die Antwort auf Ihre Bemerkungen aktualisiert. Meinst du das ist jetzt gut?

Ich werde diese Antwort in Zukunft näher erläutern, aber in der Zwischenzeit wird das Blau-Weiß-Screening verwendet, um zwischen Bakterien zu unterscheiden, die mit dem Vektor und Gen von Interesse transformiert wurden, und Bakterien, die mit einem leeren Vektor transformiert wurden. Ein leerer Vektor verleiht immer noch eine Antibiotikaresistenz und ermöglicht somit das Wachstum der Bakterien, enthält jedoch nicht das interessierende Gen und ist daher für den Forscher nutzlos.

Wenn Bakterien mit rekombinanten DNA-Molekülen beim Klonen von Genen nicht überleben, wie können sie nach der Isolierung zu einer Kolonie gezüchtet werden?
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