E. coli wächst nicht in flüssigem Medium

Wir führen regelmäßig bakterielle Transformationen und Subkulturen von Platten auf Flüssigmedien durch, um DNA zu extrahieren. Dies geht normalerweise sehr gut und ist unkompliziert, aber gelegentlich wachsen die Kolonien, die auf einer Platte gut gewachsen sind, nicht in Flüssigkultur (mit den gleichen Antibiotika, die auf der Platte waren). Dies ist nun drei Personen auf mehreren Plasmiden passiert.

Zum Beispiel habe ich versucht, ein Ampicillin-Resistenzgen (mit seinem Promotor) in das pENTR4-Plasmid (bereits mit Kanamycin-Resistenz) zu ligieren. Meine Platte und LB enthielten beide die beiden Antibiotika, aber die Kolonien schafften es erst um 16 Uhr, leicht trüb zu werden.

Eine Kontamination mit Phagen ist sehr unwahrscheinlich, und die Wirkung kann nicht auf eine Toxizität des eingefügten Fragments zurückzuführen sein, da sowohl das Insert als auch der Vektor problemlos mehrfach in denselben Bakterien gezüchtet wurden.

Hilfe?

EDIT1 - Wir verwenden Carbenicillin anstelle von Ampicillin in der Platte, aber nicht in den flüssigen Medien.

EDIT2 - Nachdem ich es geschafft hatte, einige Kolonien in Flüssigkeit zu züchten, gelang es mir, eine kleine Menge des Plasmids zu erhalten (Profil war gut; Konzentration = 70 ng/ul). Das Seltsame ist, dass ich absolut keine Probleme hatte, als ich diese DNA in Stbl3-Bakterien rücktransformierte. Glauben Sie, dass der Bakterienbestand dafür verantwortlich sein könnte?

Haben Sie kürzlich Ihre Antibiotika- oder Mediencharge gewechselt?
Die einfachste Erklärung ist etwas in Kulturröhrchen oder Medienvorbereitungsflaschen, das das Wachstum hemmt (Waschmittelrückstände?). Aber viele Leute haben gesehen, was Sie beschreiben, wenn die Platten mit Kolonien zu lange bei 4 °C gelagert wurden. - Sie können dies routinemäßig tun, viele Leute tun es. Entweder nachdem Sie CFU-Patch-Kandidaten für ein Master-Grid gefunden haben, oder, wenn Sie die Röhrchen für Mini-Preps beimpfen, patchen Sie die CFU auch auf einer frischen Platte. Wenn die gepatchte Gitterplatte wächst, aber die Kultur nicht, voila
In sehr seltenen Fällen zeigt das Patchen gesunde kleine Rasenflächen mit Nadelstichlöchern von Phagenkontamination. Wenn es sich um eine Phagenkontamination durch einen lytischen Phagen handelt, wird sich die Brühe meiner Erfahrung nach klären und ein kleines fadenförmiges Gerinnsel aus lysierten Zelltrümmern ansammeln, das schwimmt. Was wäre, wenn es einen nicht-lytischen Phagen wie M13 gäbe? Klingt so, als würden Sie die "offensichtlichen" Gründe sorgfältig abwägen. Es gibt definitiv toxische Inserts, die in normalen E. coli praktisch unmöglich zu vermehren sind, aber dann würden Sie (typischerweise) nur Transformanten ohne Inserts finden, aber das kommt glücklicherweise ziemlich selten vor
Die Antibiotika sind Vorräte, die bei -20 °C gelagert werden, und sie wurden gleichzeitig von einem Kollegen von mir verwendet, der das gleiche Problem bei einigen seiner Vektoren hatte (2/8). Da wir denselben Röhrentyp erfolgreich verwendet haben, bezweifle ich, dass dies der Grund sein könnte.
hast du es mit positiver Kontrolltransformation versucht? Von einigen Testvektoren, wie dem pEGFP-Typ
Auch Ihr Inkubator funktioniert möglicherweise nicht, manchmal ändern Leute ohne Grund die Temperatur oder schalten den Shaker aus (vielleicht hat Ihre Steckdose einen Timer, der über Nacht abläuft :)
Diese Transformation wurde mit meinem Kollegen durchgeführt; wir haben das ding zusammen gemacht. In seinen Plasmiden (Zeug, das er so wie es ist von einem anderen Labor erhalten und direkt in Bakterien transformiert wurde) hatten zwei von acht das gleiche Problem wie ich. Die anderen sind perfekt gewachsen. Es wurde in kommerziellen DH5a-Bakterien durchgeführt, die wir gerade gekauft hatten. Die Temperatur und Rotation waren in Ordnung.
Wie groß/zahlreich sind die Kolonien auf der Platte?
Die Kolonien waren klein bis mittelgroß. Es hat insgesamt keinen Unterschied gemacht.
Welchen E.coli-Stamm verwenden Sie?
Und zu Ihrem Einsatz, haben Sie auch den Terminator? Denn in deinem Beitrag erwähntest du gerade Promoter und AmpR
Ich bin mir nicht sicher über den Terminator, da er nicht beschriftet ist ...

Antworten (1)

Ich denke, dafür gibt es mehr als eine Möglichkeit.

  1. Platten mit Kolonien werden zu lange in 4C gelagert (wie von @mdperry vorgeschlagen). Dies führt dazu, dass die Kolonien das Plasmid im Laufe der Zeit verlieren, da das Antibiotikum in der Platte im Laufe der Zeit abgebaut wird. Es gibt eine Studie dazu und ich habe den Link geteilt. ( http://homepages.bw.edu/~mbumbuli/biotech/colin/index.html ).
  2. Das Insert ist für Zellen toxisch und der Promotor ist nicht stark genug. Es gibt einen undichten Ausdruck, der zum Absterben von Zellen führt.
  3. Überprüfen Sie die geeigneten Zellen und ihren Lagerzustand, da dies die Effizienz der Transformation stark beeinträchtigen würde. Führen Sie eine Scheintransformation mit einfachem Plasmid ohne Einsatz durch und verteilen Sie sie auf einer antibiotischen Platte.
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