Wie funktioniert das Blau-Weiß-Screening bei der Auswahl von E. coli, die einen Plasmidvektor aufgenommen haben?

Der Plasmidvektor, auf den ich mich beziehe, ist pCR 2.1 - TOPO. Ich fügte den Vektor zu den E. coli hinzu und plattierte sie auf eine LB+amp+X-gal-Platte und inkubierte sie dann. Nach der Inkubation befanden sich auf den Platten zwei Arten von Bakterienkulturen, eine weiße und eine blaue.

Ich denke, dass die blauen Kulturen das Plasmid akzeptiert haben, da sie in der Lage sind, auf Ampicillin zu wachsen, also das Ampicillin-Resistenzgen haben, und in der Lage sind, das X-Gal-Substrat über das lacZ-Gen in Blau umzuwandeln. Was mich verwirrt, sind die weißen Kolonien. Wenn die Kolonien in der Lage sind, auf Ampicillin zu wachsen, haben sie das Gen sicher akzeptiert, weil sie die Resistenz haben, und sollten sie sicherlich in der Lage sein, das X-Gal umzuwandeln?

Warum exprimieren diese also nicht das lacZ-Gen? Befinden sich das lac-Z-Gen und die Ampicillin-Resistenz nicht auf demselben Plasmid, oder hat es das lac-Z-Gen nicht in das Plasmid geschafft?

Welchen E. coli-Stamm haben Sie verwendet? War das ein Klon-Kit von TA? Haben Sie auch Insert-DNA irgendeiner Art hinzugefügt?
Ich glaube, es war der k12-Stamm, ja, es war ein TA-Klonierungskit, und ich fügte dem Vektor DNA von Aequoria victoria hinzu, der die Bakterien zum Fluorieren brachte

Antworten (1)

Das herkömmliche Blau/Weiß-Screening ist so aufgebaut, dass blaue Kolonien als negativ für das Insert gelten und weiße Kolonien als positiv für rekombinante DNA gelten. Das verantwortliche Gen ist das lacZ-Gen oder Beta-Galactosidase. Dieses Enzym wandelt ein synthetisches Substrat, X-Gal, in eine unlösliche blaue Verbindung um.

Das Plasmid pCR2.1 TOPO ist ein blau/weißes Selektionsplasmid, bei dem weiße Kolonien als positiv für das Insert angesehen werden. Die Art und Weise, wie dies funktioniert, besteht darin, die zu klonierende DNA-Sequenz in die kodierende Region für lacZ einzufügen. Indem eingeschleuste DNA die Sequenzen von lacZ unterbricht, so dass das Enzym seine Funktion verloren hat (weil es in den Bakterien nicht mehr korrekt übersetzt wird). Andererseits bedeutet kein vorhandenes Insert, dass lacZ wieder zusammenligiert wird und das gesamte Enzym korrekt hergestellt wird und daher das X-gal-Substrat metabolisieren kann, um einen unlöslichen blauen Farbstoff zu bilden.

Dies ist jedoch sehr sinnvoll, wenn das E. coli auf der Platte wächst, bedeutet dies sicherlich standardmäßig, dass es das Plasmid aufgenommen hat, weil es die Ampicillin-Resistenz hat? Wie überleben die blauen Kolonien auf dem Ampicillin, wenn sie das Plasmid nicht aufgenommen haben?
Das Ampicillin-Resistenzgen ist auf dem Plasmid in einer anderen Region kodiert. Jedes Plasmid, mit oder ohne Insert, enthält Ampicillinresistenz. Jede Kolonie, die auf der Platte wächst, hat ein Plasmid aufgenommen, so überleben sie, aber nicht alle haben unbedingt ein Plasmid mit dem Insert.
Oh, verstehe, also ist es ein Test, um zu sehen, ob das Plasmid mit dem Insert zusammenligiert ist, nicht um zu sehen, ob das Plasmid erfolgreich in E. coli eingefügt wurde?
Das ist richtig! Schließlich wird das Antibiotikum über die ganze Platte verteilt, also müssen Bakterien, die wachsen, bereits das Resistenzgen haben.
Wie funktioniert das Blau-Weiß-Screening bei der Auswahl von E. coli, die einen Plasmidvektor aufgenommen haben?
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