Hier ist das Ding. Ich verwende eine Methode namens TU-Tagging, um zelltypspezifische RNA zu isolieren. Mehr über die Methode finden Sie hier: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2783170/
Um es ganz kurz zu erklären, gibt es ein Enzym namens UPRT (Uracil Phosphoribosyltransferase), das in Toxoplasma gondii exprimiert wird . Unter normalen Umständen erzeugt UPRT UMP aus dem Uracil der Wirtszellen und dieses UMP wird in RNA eingebaut. Sie fanden jedoch heraus, dass dieses Enzym Uracil und das Uracil-Analogon 4-Thiouracil nicht unterscheiden kann (hat im Wesentlichen Thio an der 4. Position des Uracils). Wenn also 4-TU extern bereitgestellt wird, baut UPRT 4-TU in RNA ein und Sie erhalten Thio-RNA. Dann können Sie mit einfacher Biotinylierung und Streptaividin-Isolierung Thio-RNA aus Ihrem Gesamt-RNA-Isolat gewinnen. (Natürlich sollte UPRT auf bestimmte Zelltypen Ihres Interesses angewendet werden)
Wie auch immer, nach der Erklärung (vielleicht war es aber unnötig) hier ist meine Frage.
Nachdem ich meine sogenannte spezifische RNA isoliert habe, überprüfe ich die Reinheit durch qPCR, indem ich zelltypspezifische Marker verwende. Ich habe kein Referenzgen. Das einzige, was mich interessiert, ist das Vorhandensein oder Fehlen von Markern (und natürlich auch die Faltungsänderung). Jetzt habe ich einige Daten, aber ich weiß nicht, wie ich sie präsentieren soll (in meinem Labor gibt es niemanden, der Erfahrung mit qPCR hat, und meine Erfahrung ist einfach so begrenzt).
Habt ihr eine Idee, wie ich dieses Problem lösen kann? Ich habe mir einige Berechnungen angesehen, aber die meisten davon werden für Referenzgene oder andere Dinge benötigt. Das einzige, was ich habe, sind Zykluszahlen und die Effizienz meiner Zündhütchen. Glaubst du, ich kann mit diesen Eingaben etwas anfangen? (Ich weiß, dass Zyklusnummern in einem Diagramm nichts bedeuten, daher möchte ich im Grunde keine Zyklusnummern setzen.)
Vielen Dank für das Lesen. Jede Hilfe/Idee wäre sehr willkommen. Ich bin so verzweifelt. Danke schön.
OK, fangen wir von vorne an. Wir wissen, was einen Zelltyp von einem anderen Zelltyp unterscheidet, ist seine Expression – dh welche Gene tatsächlich in RNA transkribiert werden. Daher sollte in einem Zelltyp bestimmte RNA vorhanden sein, die in einem anderen Zelltyp nicht austreten sollte. Wenn Sie RNA aus einem bestimmten Zelltyp, sagen wir einem Neuron, isolieren und zeigen möchten, dass Ihre Proben-RNA nur neuronale RNA enthält, dann müssen Sie 2 Dinge beweisen:
Es gibt mehrere Laborverfahren, um das Vorhandensein/Fehlen bestimmter RNA-Sequenzen in einer Probe zu identifizieren, Ihre gewählte Technik ist qPCR. Hier ist eine kurze Erklärung, wie qPCR funktioniert.
Sie geben Ihre RNA-Probe zusammen mit einem sequenzspezifischen Primer in die qPCR-Maschine. Der Primer bindet an eine spezifische Sequenz und dann wird dieser Strang repliziert. Dies wird sich Zyklus für Zyklus wiederholen. Wenn Sie also mit 1 Sequenz von beispielsweise Sequenz A beginnen, werden Sie nach Zyklus 1 mit 2, dann 4, dann 8 und so weiter enden.
Wie auch immer, wenn Sie qPCR verwenden möchten, um zu beweisen, dass Ihre RNA-Probe von einem Neuron stammt, müssen Sie einige Sequenzen finden, von denen bekannt ist, dass sie für Neuronen spezifisch sind. Finden Sie dann Primer für diese Sequenzen. Verwenden Sie dann diese Primer, um etwas RNA aus Ihrer Probe zu amplifizieren. Wenn Sie eine Amplifikation erhalten, müssen Sie diese Sequenz in Ihrer RNA-Probe gehabt haben. Um sich weiter zu stützen, möchten Sie vielleicht auch einige Sequenzen nachschlagen, von denen bekannt ist, dass sie NICHT in Neuronen exprimiert werden, und nach demselben Prinzip beweisen, dass diese Sequenzen NICHT in Ihrer Probe enthalten sind.
Das obige gibt Ihnen qualitative Daten, es sagt Ihnen einfach, ob eine bestimmte Sequenz in Ihrer RNA-Probe existiert oder nicht existiert. Da Sie nur an der Anwesenheit oder Abwesenheit von Markern interessiert sind, sollte dies ausreichen. Wenn Sie jedoch Ihre Daten quantifizieren möchten, dh herausfinden möchten, wie stark eine bestimmte Sequenz exprimiert wird, dann lesen Sie weiter.
Sie können auch quantitative Daten von qPCR erhalten (immerhin steht qPCR für quantitative PCR). Die Anzahl der Kopien einer RNA-Sequenz nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen ist proportional zur ursprünglichen Anzahl der Kopien dieser Sequenz in Ihrer Probe. Mit anderen Worten, wenn Ihre anfängliche RNA-Probe viel SequenzA und wenig SequenzB enthält, sollten Sie bei jedem Zyklus mehr SequenzA sehen.
Diese Beziehung können wir nutzen. Es gibt zwei allgemeine Methoden, mit denen Sie Ihre Ergebnisse quantifizieren können. Die eine heißt absolute Quantifizierung und die andere relative Quantifizierung.
Die Idee hinter der absoluten Quantifizierung ist, dass Sie zwei qPCRs durchführen. In einem machen Sie Ihre RNA-Probe. Im zweiten führen Sie eine Standardprobe aus, für die eine Standardkurve verfügbar ist. Sie können dann die Ergebnisse Ihrer RNA-Probe mit den Ergebnissen des Standards vergleichen, um eine Vorstellung von der Anzahl der Kopien in Ihrer Probe zu bekommen.
Die Idee hinter der relativen Quantifizierung ist, dass Sie die qPCR-Ergebnisse für Ihre interessierende Sequenz mit den qPCR-Ergebnissen eines Referenzgens vergleichen. Dies gibt Ihnen nur eine Vorstellung davon, wie oft Ihre interessierende Sequenz mehr oder weniger exprimiert wird als das Referenzgen. Da Sie kein Referenzgen haben, können Sie diese Methode nicht verwenden, aber Sie können die absolute Quantifizierungsmethode verwenden, die im obigen Abschnitt erklärt wird!
Hier sind sehr nützliche Links zur Quantifizierung mit qPCR: http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction#Quantification_of_gene_expression
http://relative.gene-quantification.info/
Lassen Sie mich wissen, wenn Sie weitere Erläuterungen benötigen.
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