Reverse-Transkription-PCR-Optimierung

Was ist die ideale Menge an RNA für die RT? und wie viel cDNA verwendet man dann für die PCR?

Ich habe RT mit einer RNA-Lösung von 0,36 ug/ul durchgeführt. Dann verwendete ich für meine PCR 1 ul der erhaltenen cDNA und verwendete 25 Zyklen, weil ich hoffte, einen Unterschied zwischen einem endogenen Niveau und einer Überexpression zu sehen. Allerdings habe ich bei der erwarteten Höhe von 500 bp keine Bande entdeckt, sondern eine diffuse Bande bei 100 bp. Was können diese 100 bp darstellen? Primer-Dimer? Ich wechselte zu 35 Zyklen und verwendete entweder die gleiche Menge an cDNA oder fügte dreimal mehr cDNA hinzu. In beiden Fällen erhielt ich Banden in der erwarteten Höhe (aber stärker, wenn ich mehr cDNA einsetzte) und immer noch große Banden bei 100 bp.

RT-PCR bezieht sich auf reverse Transkription, nehme ich an? Nicht zur Echtzeit-PCR?
@Alexander Galkin Warum hast du das PCR-Tag entfernt? Ich denke, die Frage bezieht sich wirklich auf RT-PCR und nicht auf RT im Besonderen.
@GerganaVandova Glauben Sie, dass wir ein spezielles Tag für RT-PCR brauchen? Ist das nicht zu eng? Ich war mir nicht sicher, ob ich es korrigieren sollte "PCR" oder "umgekehrte Transkription" und entschied mich für das letzte. Wenn Sie der Meinung sind, dass es falsch ist, können Sie die Frage gerne neu markieren. Sie ist in der Community mehr als willkommen.
@Alexander Galkin Ja, ich glaube, die Frage bezieht sich eher auf PCR als auf RT. Sie haben wahrscheinlich Recht, dass der RT-PCR-Tag zu spezifisch ist. Das PCR-Tag ist gut genug.
Ich stimme Gergana zu, das ist eine PCR-Frage. Ich glaube auch, dass ein PCR-Tag für alle seine Variationen (RT-, Q-, verschachtelt usw.) ausreichen sollte.

Antworten (2)

Ich sehe auch große unscharfe Bänder um 100 bp. Sie sind höchstwahrscheinlich eine RNA-Kontamination . Um sie loszuwerden, verdauen Sie Ihre RT-PCR-Produkte mit RNAse-H. Aber wenn Sie nur Ihr Interessenband visualisieren müssen und die Fuzzy-Bänder nicht im Weg sind, sollte dies kein Problem sein.

Normalerweise gebe ich zwischen 1 und 2 ug RNA in meine RT-PCR-Reaktion unter Verwendung des Invitrogen Superscript III-Kits für ein Gesamtvolumen von 20 ul ein. Nach der Reaktion verwende ich 1/10 des Volumens davon (2 ul) für Downstream-Anwendungen (PCR). Dadurch erhalte ich normalerweise schöne Ergebnisse.

Um die RT-PCR für den Nachweis eines bestimmten Ziels zu optimieren, ziehen Sie die Verwendung von genspezifischen Primern in Betracht (achten Sie darauf, nur Antisense-Primer zu verwenden) in Ihrer RT-PCR anstelle von Oligo-dT oder zufälligen Hexameren. Dies bereichert Ihr Ziel, wenn Sie es für nachgelagerte Anwendungen verwenden. Wenn Sie jedoch GSPs verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie eine parallele Reaktion mit Kontrollprimern (dh Beta-Aktin) durchführen, um zu beweisen, dass Ihre RT-PCR-Reaktion funktioniert.

Es gibt keine einzelne „ideale Menge“ an RNA. Ich würde Ihnen vorschlagen, eine Titrationskurve zu erstellen, um die beste Menge für Ihren spezifischen Assay zu bestimmen. Die Bande bei 100 bp könnte eine unspezifische Amplifikation sein. Sie könnten versuchen, die Glühtemperatur leicht zu erhöhen, um zu sehen, ob dadurch das untere Band entfernt (oder reduziert) wird. Alternativ können Sie ein anderes Primer-Set oder sogar eine verschachtelte PCR in Betracht ziehen. Außerdem ist es immer noch möglich, dass Sie sich eine Spleißalternative in diesem Band ansehen. Überspannen Ihre Primer mehr als ein Exon?

Reverse-Transkription-PCR-Optimierung
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v