Hilfe bei der Analyse von SDS-Page-Gel

In diesem Experiment transformierten wir eine Verkürzung der NFAT-Proteinsequenz in einen Plasmidvektor, der in E. coli als ein Fusionsprotein mit GST exprimiert werden sollte. Wir haben auch versucht, das normale Plasmid ohne NFAT zu transformieren, so dass wir nur GST erhalten konnten. Nachdem wir diese Kolonien aufgezogen und positive Kolonien selektiert hatten, lysierten wir die e.coli. Wir sammelten etwas von diesem Lysat für SDS-PAGE. Wir haben dann die lysierten GST- und GST-NFAT-Lösungen in separate Säulen mit Glutathion-Kügelchen gegeben. GST bindet Glutathion. Wir haben die Säule gewaschen und einen Teil der Waschflüssigkeit für die SDS-PAGE gesammelt. Schließlich eluierten wir GST und GST-NFAT von der Säule und bewahrten etwas für SDS-PAGE auf.

Ich habe ein Bild einer erfolgreichen Version der SDS-PAGE beigefügt.

Sie möchten Ihre Aufmerksamkeit auf die erste Spur lenken, den Molekulargewichtsmarker (MWM). Der Rest der Bahnen sollte in Sätzen von 3 interpretiert werden. Die erste der drei ist das Rohlysat, die zweite der drei ist die erste Waschung und die letzte ist das eluierte Protein von Interesse. Die wichtigen Spuren für meine Analyse sind 8-10 und 11-13.

Ich werde erklären, was ich bisher von diesem SDS-PAGE-Gel weiß. Ich kenne die Gewichte der verschiedenen Banden im Molekulargewichtsmarker, weil mir eine Kopie der verschiedenen Proteine ​​im Marker gegeben wurde. Anhand dieser Informationen konnte ich bestätigen, dass ich mein interessierendes Protein in Spur 13 und GST-allein in Spur 10 isoliert habe. Ich verstehe auch den Grund, warum die Lysatspuren am dunkelsten sind, gefolgt von den Waschspuren und dann sehr sauber Bahnen für Protein von Interesse. Beachten Sie auch, dass der Marker und die Elutionsspuren mit 10 Mikrolitern geladen wurden, während die anderen Spuren jeweils 2 Mikroliter waren. Es gibt jedoch einige Dinge, die ich von dem Gel nicht verstehe.
(1) Warum sind die Bänder so diffus/geringe Auflösung? Ich kann mir vorstellen, dass es die Brunnen überlastet, aber ich bin nicht überzeugt, weil ich ein festgelegtes Verfahren befolgt habe.
(2) Warum gibt es große Mengen an Streifenbildung, insbesondere in den Bahnen 5, 8, 9, 10 und 11.
(3) Ich habe mein interessierendes Protein isoliert, weil es ein Fusionsprotein mit GST (oder nur GST allein) war, und eluierte dann das Protein von den Glutathion-Kügelchen durch Waschen mit überschüssigem Glutathion. Theoretisch sollten die Bahnen für die Elutionen dann frei von allem außer dem interessierenden Protein und Glutathion sein. Dies gilt vor allem für die Bahnen 4 und 9, die nur GST und Glutathion enthalten sollten. Die Bahnen 7 und 13 sollten jedoch nur GST-NFAT und Glutathion enthalten. Die Bahnen sind jedoch nicht so klar und scheinen zahlreiche andere Proteine ​​angefärbt zu haben. Was ist los?
(4) Mir wurde von einem Professor gesagt, dass die zweite Bande in Bahn 13 (die GST-NFAT-Bahn) ein Abbauprodukt sei. Wie kann das sein? Das Band entspricht nicht den Gewichten von NFAT allein oder GST allein. Wenn die NFAT-GST abgebaut wäre, gäbe es dann nicht auch zwei Bänder von Abbauprodukten?
(5) Warum haben die GST-allein-Spuren etwas, das wie Doublet-Bands aussieht? (Spuren 4, 10).
(6) Wenn wir die interessierenden Proteine ​​mit überschüssigem Glutathion eluierten, das ein sehr niedriges Molekulargewicht hat, warum erscheint es dann nicht auf dem Gel? Ist es möglich, dass es vor allem anderen weggelaufen ist?
(7) Ich habe eine Liste der Gewichte der Banden des molekularen Markers. Allerdings gibt es unten eine zusätzliche Band, die nicht auf meiner Liste auftaucht. Kann es sein, dass meine Liste unvollständig ist oder passiert etwas anderes?

Abschließend habe ich ein Bild eines fehlgeschlagenen SDS-PAGE-Gels beigefügt.

Das Einzige, was ich definitiv als Fehlerquelle kenne, ist die Tatsache, dass mein Buffer Level während des Laufs gesunken ist (aufgrund eines Lecks). Die Ergebnisse dieses Gels sind genau (Spuren 2–7 entsprechen den Spuren 8–13 auf dem obigen Gel, und die Ergebnisse sind fast identisch), aber das Gel stellte sich als schrecklich heraus. Wie kann das Herunterfallen des Puffers dieses Ergebnis verursachen? Oder gibt es etwas anderes, das zu diesem seltsamen Muster beigetragen haben könnte? Schließlich sind die Bahnen in diesem Gel nicht so deutlich wie im ersten Gel, es wurden jedoch der gleiche Kamm und somit die Vertiefungen mit der gleichen Größe und dem gleichen Abstand verwendet. Warum gab es also so viel Bluten zwischen den Fahrspuren / Platzmangel zwischen den Fahrspuren?

Vielen Dank im Voraus für jede Hilfe.