Lämmli-SDS-PAGE Probleme [geschlossen]

Dein Gel sieht für mich gut aus. Es zeigt einfach an, dass Ihr Ammoniumsulfat-Präzipitat große Mengen dieses kleinen Proteins am Boden enthält (was auch immer das ist). Die oberen Bänder sehen gut aus, die Belastung ist angemessen: Sie sind nicht überladen wie das untere, aber auch nicht zu schwach. Die Tatsache, dass Ihre erste und letzte Bahn etwas schmierig aussehen, liegt an der massiven Menge des kleinen Proteins (Bahnen sehen schmierig aus, wenn sie so stark überladen sind). Das untere Band ist definitiv wirklich etwas Protein und kein Färbeartefakt; Ich habe diese Form zuvor mit gereinigten Proteinen gesehen, die auf SDS-PAGE überladen wurden.

Eine Sache, die Sie tun könnten, vorausgesetzt, Sie haben noch genug von diesen Proben, ist, ein ergänzendes Gel mit 100-mal weniger Material zu verwenden. Um den Faktor 1/100 in 1X Laemmli-Denaturierungspuffer verdünnen und ein neues Gel mit dem gleichen Volumen wie dieses laden. Sie werden die oberen Bänder nicht mehr sehen, aber Sie werden ein viel saubereres unteres Band haben, dem Sie hoffentlich ein scheinbares Molekulargewicht zuweisen können (oder sogar zur Identifizierung der Massenspezifikation ausschneiden können; tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie saubere Werkzeuge, wenn Sie tun, sonst werden sie meistens Keratin von Ihrer Haut erkennen).

Angenommen, der Zweck dieses Gels bestand darin, das Ergebnis der als Reinigungsschritt verwendeten Ammoniumsulfatfällung zu überprüfen, funktionierte es offensichtlich nicht gut, alle diese Banden zu trennen, und Sie müssen möglicherweise verschiedene Konzentrationen wiederholen und ausprobieren. Aber wenn das untere Band dasjenige ist, das Sie zu reinigen versuchen, dann waren Sie erfolgreich (die oberen Bänder stellen weniger als 10 % Kontamination dar, würde ich nach Augapfelschätzung sagen). Wenn Sie an einer der Top-Bands interessiert sind, dann hat es eindeutig nicht funktioniert.

Ist eine dieser Bahnen der Überstand? Wenn ja, dann hast du dort auch riesige Mengen des kleinen Proteins (es ist in jeder Spur). Eine so hohe Anreicherung sieht verdächtig aus: Könnte das gereinigtes Lysozym sein, das Sie während des Reinigungsverfahrens hinzugefügt haben, um den Abbau der Bakterienzellwand zu unterstützen? (vorausgesetzt, Sie versuchen, ein in E. coli überexprimiertes Protein zu reinigen ).