Bindung zweiwertiger Kationen an Calmodulin

Ich habe eine native PAGE mit 4 Reaktionsgemischen durchgeführt. Zu jedem hatte ich ein gleiches Volumen EDTA (1 ul/1 mM) hinzugefügt, um alle zweiwertigen Ionen zu sequestrieren, und ein gleiches Volumen Calmodulin (5 ul/0,5 mg/ml). Ich fügte 2 ui Calcium- (2 mM), Magnesium- (2 mM) bzw. Mangan- (2 mM) Ionen zu drei Reaktionsmischungen hinzu und hatte eine Kontrolle, die mit Tris-HCl auf ein gleiches Volumen aufgefüllt wurde. Alle Reaktionsmischungen wurden mit Tris-HCl auf 10 &mgr;l aufgefüllt. Hier hatte ich ein Problem mit den Wasserbädern und die Reaktionen konnten nicht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden.

Nachdem ich den Ladepuffer zu jedem hinzugefügt hatte, fügte ich die 4 Reaktionsmischungen zu dem Polyacrylamidgel hinzu und führte 45 Minuten lang eine Elektrophorese bei 150 V durch. Danach legte ich das Gel 20 Minuten lang in Coomassie-Blau-Färbung.

Nach dem Entfärbungsprozess überprüfte ich das Gel und stellte fest, dass das Calmodulin in den 4 Bahnen um die gleiche Strecke gewandert war. Ich hatte erwartet, dass die EDTA-Kontrolle am weitesten auf dem Gel gewandert ist, wobei Ca2+ und Mn2+ aufgrund ihrer ähnlichen Ionenradien ähnliche Entfernungen wandern; wodurch es ein guter Ersatz für die Bindung an das Calmodulin ist. Ich war mir nicht sicher, wie weit Mg2+ reisen würde, da ich dachte, dass es aufgrund seiner Bindung an den N-Terminus und nicht an den C-Terminus eine geringere Affinität zum Calmodulin haben würde. Ich habe mich jedoch gefragt, ob dies in Abwesenheit von Ca2+ vernachlässigbar ist, obwohl ich mir jetzt aufgrund der Ergebnisse des Gels nicht sicher sein kann.

Ich habe mich gefragt, welche Fehler im experimentellen Design oder Prozess dazu geführt haben könnten? Und wenn das Experiment korrekt durchgeführt wurde, welche Ergebnisse wären zu erwarten?

Das erste Bild ist das Ergebnis, das ich erwartet hatte. Das zweite sind die Ergebnisse meiner Gelelektrophorese.

Das war das Ergebnis, das ich erwartet hatte

Dies ist das Ergebnis, das ich erhalten habe

Warum EDTA hinzufügen, wenn Calmodulin Ionen binden soll? Erwarten Sie, dass nur die Ionenbindung die Migrationsrate beeinflusst?
Die Bindung eines Kations würde die Mobilität nicht so stark verändern, dass sie durch Elektrophorese nachweisbar wäre.
Wenn Sie die zweiwertigen Ionen sequestrieren möchten, benötigen Sie viel mehr EDTA. Es komplexiert eine äquivalente Menge an Ionen, also komplexiert 1 mM EDTA 1 mM Calcium (zum Beispiel). Wenn Ihre EDTA-Lösung 1 mM, aber Ihre Ionenlösung 2 mM ist, wird dies niemals funktionieren.
Entschuldigung, es wurden Änderungen vorgenommen, um die Konzentrationen aufzunehmen. EDTA wurde unter der Anweisung meines Vorgesetzten hinzugefügt, was ich damals nicht in Frage stellte. Ich hatte den Eindruck, dass die Migration durch die vorhandene Literatur nachweisbar wäre.
Und mit der Zugabe von EDTA zu jeder Reaktionsmischung sollten alle zweiwertigen Ionen aus dem Protein sequestriert werden, bevor die Zielionen (Ca 2+ , Mg 2+ und Mn 2+ ) jeweils zugegeben wurden. Ich dachte, die Ionenbindung in diesem Schritt würde nicht unterbrochen, da die Ionen in einem zweifachen molaren Überschuss von EDTA vorliegen und daher Calmodulin binden und seine Verzögerung verursachen könnten? Was würde auf den Gelen aufgenommen werden?
Aus welchem ​​Artikel stammt diese Figur? Außerdem sollten Sie Ihr Gel entfärben.
Sie können keine Mobilitätsverschiebung in SDS-PAGE sehen (selbst in diesem Bild, das dies behauptet). Die Verschiebung der nativen PAGE ist auf Konformationsänderungen bei der Ionenbindung zurückzuführen. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass ein Ion unter denaturierenden Bedingungen der SDS-PAGE an ein Protein gebunden bleibt.

Antworten (1)

Die Änderung der Gelwanderungsdistanz ist auf die Konformationsänderungen aufgrund der Bindung des Ions zurückzuführen und hat nichts (nachweisbar) mit dem Ionenradius des Ions zu tun.

Das linke Bild zeigt Calmodulin ohne gebundenen Liganden, und das rechte Bild zeigt es mit daran gebundenem Calcium und Peptid.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Wie Sie deutlich sehen können, ist das ungebundene Calmodulin deutlich dünner und kann daher schneller durch das Gel wandern. Die Ladungsänderung auf dem Protein aufgrund der Kationenbindung in der nativen PAGE kann ebenfalls das Ergebnis beeinflussen.

Da die Konformationsänderung von Calmodulin sowohl durch ein Peptid als auch durch Calciumkationen sowie durch seinen Phosphorylierungszustand verstärkt wird, wäre es sinnvoll, die Beiträge dieser Faktoren zu Ihrem Ergebnis zu untersuchen. Es kann auch hilfreich sein, die Originalarbeit erneut zu lesen, um zu sehen, was Sie beim ersten Mal verpasst haben.

Ja, das linke Feld ist Apo-Calmodulin, aber Ca(II)-Calmodulin ähnelt auch der Struktur im linken Feld (mit geringfügiger struktureller Anpassung). Die hauptsächliche Konformationsänderung im rechten Feld ist ein Ergebnis der Peptidbindung, die nicht Teil des Experiments in der Frage ist.
@SYK Ich bin mir ziemlich sicher, dass Peptid nicht binden kann, ohne dass auch Kalzium bindet.
Bindung zweiwertiger Kationen an Calmodulin
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