Wie kann man die Stabilität eines Proteins anhand von Trp-Fluoreszenz- vs. [Denaturierungsmittel]-Kurven charakterisieren?

Papiere, die ich mit dieser Methode gesehen habe, zeigen, dass es möglich ist, den Anteil des denaturierten Proteins zu berechnen, indem die Verschiebung der Peak-Emissionswellenlänge analysiert wird.

Hast du das mal mit deinen Daten versucht? Was erhalten Sie, wenn Sie die Spitzenemissionswellenlänge als Funktion der Denaturierungsmittelkonzentration auftragen? Wenn diese wie sigmoidale Kurven (möglicherweise benötigen Sie eine logarithmische Skala auf der X-Achse) mit einem klaren oberen Plateau aussehen, können Sie die in diesen Artikeln erwähnte Methode anwenden, da das von Ihnen beobachtete Signal mit dem Anteil an denaturiertem Protein und gesättigten Proteinen korreliert ( dieser Teil ist wichtig: Das Signal muss über eine bestimmte Konzentration des Denaturierungsmittels hinaus gesättigt sein, da alle Proteinmoleküle vollständig denaturiert sind und daher das Hinzufügen von mehr Denaturierungsmittel keine weitere Signaländerung bewirkt; wenn Ihr Signal nicht gesättigt ist, stimmt etwas nicht) .

Sie verwenden jedoch monomere Proteine ​​mit wenigen Trp, während ich ein Dimer mit mehreren Trp habe

Der oligomere Zustand und die Anzahl der Trp-Reste sollten keine Rolle spielen, da die Peak-Emissionswellenlänge nur mit dem Anteil des denaturierten Proteins korreliert. Die Gesamtintensität nimmt mit mehr Trp-Resten zu, aber Sie verwenden die Intensität nicht als Maß für den Anteil des denaturierten Proteins (und wenn überhaupt, ist es gut, angesichts des Löscheffekts, den Sie bei zunehmender Denaturierungsmittelkonzentration beobachten, von Anfang an eine höhere Intensität zu haben ).

plus einige zusätzliche Variabilität, die durch die verschiedenen Liganden eingeführt wird.

Um dieses Problem zu lösen, benötigen Sie zwei Steuerelemente, die:

1. beweisen, dass keiner der Liganden die Fluoreszenz Ihres Proteins verändert,
2. beweisen, dass keiner der Liganden Fluoreszenz zwischen 300 und 450 nm emittiert, oder wenn doch, müssen Sie sie messen, um sie von Ihrem Gesamtspektrum abziehen zu können, um den Proteinbeitrag zur Gesamtfluoreszenz wiederzugewinnen.

Zeichnen Sie für 1 Fluoreszenzemissionsspektren des Proteins ohne Denaturierungsmittel, aber als Funktion der Ligandenkonzentration (über einige Größenordnungen) auf und prüfen Sie, ob sich die Peak-Emissionswellenlänge mit der Ligandenbindung ändert (sie könnte sich ändern, was bedeutet, dass derselbe Assay kann Ausbeutebindungskurven und Kd-Werte für Ihre Liganden, die ebenfalls nützlich sein könnten!). Vollständige Ligandentitrationskurven wären die robusteste Kontrolle, aber Sie können einfach die gleichen Ligandenkonzentrationen verwenden, die in den Denaturierungsexperimenten verwendet werden.

Für 2 wäre der einfachste Fall, dass Ihre Liganden nicht fluoreszieren, aber das können Sie nicht einfach annehmen. Daher ist eine wichtige Kontrolle, die Sie auch benötigen, die Aufnahme von Emissionsspektren für jeden Ihrer Liganden bei den in den Denaturierungsexperimenten verwendeten Konzentrationen, und dies bei jeder Konzentration des Denaturierungsmittels (oder einfach bei 0 und maximaler Konzentration: wenn es keinen Unterschied zwischen diesen gibt zwei Spektren, Sie müssen nicht bei jeder Konzentration dazwischen eines aufnehmen). Wenn die Liganden Fluoreszenz zwischen 300 und 450 nm emittieren, müssen Sie diese von Ihrem Gesamtspektrum abziehen, um nur die vom Protein ausgehende Fluoreszenz wiederzugewinnen.