Ich habe die Konzentrationen meiner Proteinlösungen gemessen, indem ich sie 20-fach in Wasser mit einem Endvolumen von 100 ul verdünnt und dann die Extinktionen dieser Lösungen in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Plattenlesegerät gemessen habe. Ich kann mich nicht erinnern, bis heute irgendwelche Probleme gehabt zu haben.
Ich habe heute 20 mM Phosphatpuffer anstelle von Wasser verwendet, um sie zu verdünnen, und die Extinktionen bei 280 nm wiederholt dreimal gemessen, und die Extinktion für eine der Lösungen stieg von 0,043 auf 0,068 (die Extinktion von 20 mM Phosphatpuffer beträgt 0,030 bei 280 nM mit gleiche Lautstärke); Ich habe nach dem dritten aufgehört zu messen, aber es würde wahrscheinlich höher werden, wenn ich gemessen habe, bis ich ein Plateau erreicht habe.
Ich habe die Extinktionen von zwei Proteinen gemessen und nur eines davon stieg so stark an, das andere stieg von 0,071 auf 0,088; Wenn dies konzentrationsabhängig wäre, würde ich erwarten, dass die zweite Lösung noch höher geht, aber es ist nicht passiert.
Ich weiß, dass es Unterschiede in der UV-Absorption geben kann, wenn Protein gefaltet oder ungefaltet ist; wäre es so dramatisch? Was ist der Grund für diesen Anstieg? Für eine Erklärung und eine praktische Lösung des Problems wäre ich dankbar.
HINWEIS: Ich erhöhte das Gesamtvolumen auf 200 ul, indem ich einfach 100 ul 20 mM Phosphatpuffer in alle Vertiefungen hinzufügte, und der Signalanstieg verlangsamte sich stark; Es gibt jedoch immer noch einen gewissen Anstieg mit 0,001-0,003-Schritten bei jeder Messung.
Es sieht so aus, als ob Ihre Proteinkonzentrationen direkt an der Nachweisgrenze des Spektrophotometers liegen und dass durch das Ändern des Verdünnungspuffers ihre Konzentrationen geändert wurden. Die Proben wurden nach der Verdünnung und vor der Messung möglicherweise nicht gründlich gemischt, so dass die unterschiedlichen Messungen einfach darauf zurückzuführen sein können, dass sich die Lösung ins Gleichgewicht bringt. Auch die Temperatur kann die Extinktion beeinflussen, daher sollten Sie überprüfen, ob sich Ihre Proben äquilibriert haben, bevor Sie Schlussfolgerungen ziehen. Wenn die Absorption Ihres Phosphatpuffers 0,03 beträgt, würde ich versuchen, die Probenabsorptionen über 0,075 oder höher zu halten, um zu vermeiden, dass Sie zu nahe an die Nachweisgrenze kommen. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihr Puffer nicht zu alt oder mit etwas kontaminiert ist, das seine Absorptionseigenschaften beeinträchtigen könnte.
Ich würde vorschlagen, ein oder zwei Proteinproben zu nehmen und eine Verdünnungsreihe (1:1, 1:5, 1:10, 1:20) in einem ziemlich großen Volumen durchzuführen (sagen wir jeweils 400 ul, wenn Sie es entbehren können). kurz vortexen, um gut zu mischen, dann dreifach jede Verdünnung auf Ihrem Lesegerät messen, zusammen mit den entsprechenden Blindproben (nur Puffer). Sie werden Unterschiede zwischen den einzelnen Messungen sehen, aber sie sollten ziemlich klein sein, abhängig von der Genauigkeit und Präzision Ihres Instruments.
Die gemessenen Werte werden von Messung zu Messung nicht genau gleich sein, und es würde viel mehr als drei Wiederholungen erfordern, um festzustellen, ob tatsächlich ein Drifttrend aufgetreten ist. Messen Sie Ihre Probenplatte eine Stunde lang alle 5 Minuten und zeichnen Sie die Werte auf (nicht nur mit dem Auge), um zu sehen, ob die Maschine möglicherweise gewartet werden muss.
Könnte Proteinentfaltung oder Konformationsänderungen sein. Die Absorption bei 280 nm ist hauptsächlich auf die Tryptophanreste zurückzuführen und kann sich wesentlich ändern, wenn sich diese Reste von einer hydrophoberen (im Protein vergrabenen) zu einer hydrophileren (dem Lösungsmittel ausgesetzten) Umgebung bewegen. Ihr Protein reagiert möglicherweise auf den neuen Puffer.
Alan Boyd
Engin Yapici
MattDMo
Engin Yapici