Probleme mit SDS-PAGE, keine Trennung - was könnte das Problem sein?

Ich arbeite in einem Labor, wo wir einen gemeinsamen Vorrat an 30 % Acrylamid, TEMED, TRIS-HCl (pH 6,8 und pH 8,8) und einer 10 % (w/v) SDS-Lösung pH 7,2 haben.

Wir verwenden das Rezept für Ladepuffer (den wir natürlich vor Gebrauch mit BME mischen):

  • 3,15 ml MilliQ-Wasser
  • 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl
  • 2,9 ml 85 % Glycerin
  • 2 ml 10 % SDS
  • 0,4 ml 0,5 % (w/v) Bromphenolblau

Unser Problem ist, dass es keine Trennung gibt.

Ich habe versucht, 2 Gele herzustellen, weil ich dachte, ich hätte das Trenn- und das Stapelgel gemischt, aber ich habe darauf geachtet, dass ich dies nicht beim zweiten Mal mache. Dann bat ich jemand anderen, das Gel herzustellen, und es funktionierte auch nicht (nichts auf dem Gel, keine Proben, keine Leiter).

Dann habe ich die 10%ige SDS-Lösung und beide TRIS-Puffer neu hergestellt, aber wieder passiert etwas Seltsames, da wir nichts auf das Gel bekommen.

Die Gele werden offensichtlich als festes Gel polymerisiert, wenn Sie sie zum Färben und Entfärben herausnehmen, und ich verstehe nicht, wie der Ladepuffer dies tun kann, selbst wenn Sie ihn vermasseln (weil Sie etwas auf dem Gel sehen sollten, solange Ihre Probe im Brunnen, auch ohne Denaturierung). Wir haben offensichtlich den Ladefarbstoff neu erstellt und es erneut versucht, aber das funktioniert nicht.

Ich weiß, dass die Proben Protein enthalten, da ich Zellpellets und gereinigtes Protein (dessen katalytische Aktivität ich getestet habe) auf dasselbe Gel gebe.

Hat jemand eine vernünftige Erklärung dafür oder Vorschläge, was typischerweise falsch sein kann.

Unten ist ein Bild des Gels, wie es aussieht, wenn es fast fertig ist und bei 200 V (80 mAmp) für ca. 40 Minuten läuft. Wenn wir färben und entfärben, befindet sich nichts auf dem Gel. Außerdem denke ich, dass die Farbe (Bromphenolblau) so aussieht, als würde sie etwas seltsam auf dem Gel verlaufen, nicht so, wie es normalerweise sollte, siehe Bild unten, aber vielleicht werde ich etwas paranoid.

Gel läuft bei 200 V mit 80 mAmp

Hast du versucht, ein anderes Protein zu verwenden? Oder das Protein aus dem Gel herausfärben, um zu sehen, dass es sich wirklich färbt?
Versuchen Sie auch, eine vorgefärbte Proteinleiter in einer der Vertiefungen zu verwenden. (Vorzugsweise eines, das fertig gemischt geliefert wird und kein Laden von Farbstoff/Erhitzen/BME benötigt.) Das sollte Probleme mit Ihren Gel-/Laufbedingungen von Problemen mit Ihrem Protein/Ladefarbstoff/Färbeprozess trennen.
Können andere Personen in Ihrem Labor Proteine ​​in ihren Gelen sehen? Nicht Ihr spezifisches Protein, sondern jedes andere Protein, mit dem sie arbeiten. Falls Sie keine vorgefärbten Marker haben, sollte Ihnen dies auch sagen, ob es sich um ein Gel-/Färbungsproblem oder ein Problem mit Ihrem spezifischen Protein handelt. Außerdem, wie viel Protein laden Sie?
Danke für die Eingabe, nachdem der pH-Wert von allem neu eingestellt und neuer Laufpuffer mit neuer SDS-Lösung hergestellt wurde, scheint die Trennung zurück zu sein. Es ist immer noch ein bisschen ein Rätsel, aber vielleicht ist das SDS (plötzlich) alt geworden und da es sowohl im Ladefarbstoff als auch im Laufpuffer und im Gel enthalten ist, hat es einfach nicht funktioniert. Ich habe ein bisschen gelesen und es scheint, dass einige sagen, dass das 10% SDS nicht älter als 6 Monate sein sollte, unseres war 5 Jahre alt, hat aber bis vor einer Woche einwandfrei funktioniert.

Antworten (1)

Nachdem der pH-Wert von allem neu eingestellt und neuer Laufpuffer mit neuer SDS-Lösung hergestellt wurde, scheint die Trennung zurück zu sein.

Probleme mit SDS-PAGE, keine Trennung - was könnte das Problem sein?
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