Protein wandert in Bis-Tris- und Tris-Glycin-Gelen unterschiedlich. Mich interessierten die eigentlichen Gründe dafür. Führen bestimmte Gelsysteme zu einer engeren Auflösung als andere?
Das SDS-PAGE-System beruht auf der Tatsache, dass das Protein denaturiert und von der negativ geladenen SDS-Detergensmizelle umgeben ist. Dies eliminiert die meisten Ladungs- und idiosynkratischen Löslichkeitsunterschiede von einem Protein zum anderen und ergibt eine vernünftige Trennung, die nur auf der Größe des Proteins basiert, die mit der Größe der SDS-Micelle um jedes Molekül in Beziehung steht.
Bis-Tris- und Tris-Glycin-Puffer haben ganz unterschiedliche Ladungsabschirmeigenschaften. Bis (auch bekannt als 2-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol) hat ein tertiäres Amin mit einem pKa von 6,46 und einem pKb von 7,54. Glycin ist bei jedem pH-Wert zwischen 2,3 und 9,6 ein Zwitterion. Dies erzeugt einen Unterschied in der Art und Weise, wie der Puffer die SDS-PAGE-Mizellen vom Rest des elektrischen Felds abschirmt, was die Zeit bis zur Auflösung verlangsamt (wahrscheinlich verlangsamt Glycin die Dinge ein wenig), aber den Mizellen auch mehr Zeit zum Wandern gibt.
Bei SDS-PAGE-Systemen hat die Auflösung des Gels also mindestens genauso viel mit der Größe der Gelporen (basierend auf den Acrylamid- und Bis-Acrylamid-Prozentsätzen) und der Proteinmenge zu tun, die Sie in ein bestimmtes Beladungsvolumen geben Nun, und die Größenunterschiede der Bänder, die Sie trennen möchten. (Sie müssen ziemlich viel Glück haben, um eine 100,54-kDa-Bande von einer 100,85-kDa-Bande zu trennen, aber 1,5 bis 1,8 kDa sind einfacher, 10 bis 14 kDa sind noch einfacher). Erwägen Sie auch, den Strom oder die Spannung der Stromversorgung anzupassen. Das Puffersystem ist nur ein Aspekt bei der Planung Ihres Experiments und oft nicht der primäre Qualitätsfaktor.