Wie werden virale Genome in CRISPR-Bakterien in die Abstandshalter von CRISPR integriert? Wo schneidet Cas9 bei seiner Verwendung die DNA?

Dieses Papier sollte viel mehr über das CRISPR-System aufklären, als irgendjemand hier wirklich kann.

CRISPR/Cas9 ist sehr einzigartig, selbst im Vergleich zu anderen aus Bakterien gereinigten Proteinen wie Taq Poly.

Der Grund liegt darin, wie komplex es tatsächlich ist, dieses Protein zu induzieren. Im Wesentlichen transfizieren Sie ein Plasmid mit dem Cas9-Protein und seiner Leit-RNA (gRNA) auf dem Vektor. Die Transfektion selbst ist nicht einfach, ganz zu schweigen davon, dass Sie einer Zelle im Wesentlichen einen Mechanismus hinzufügen, der versucht, Gene auszuschalten, und Sie haben eine Handvoll. Tatsächlich würde es ausreichen, dies für eine Zelllinie zu tun und die Auswirkungen dessen zu notieren, was Sie ausschalten, um einen Artikel in einer ziemlich einflussreichen Zeitschrift zu produzieren. (Bild von: https://www.systembio.com/ )

Zu den jüngsten Fortschritten in CRISPR gehören auch:

• Lichtinduziertes CRIPSR/Cas9 (leichtere Regulation der enzymatischen Aktivität)

Grundsätzlich versuchten diese Forscher, eine Methode abzuleiten, die eine bessere Kontrolle der CRISPR-Technik ermöglicht, da CRISPR Probleme mit Off-Target-Effekten hatte. Es ist zwar keine Änderung in der Funktionsweise von CRISPR oder sogar wo, die Änderung besteht jedoch darin, wie sehr Sie die Reaktion kontrollieren können. Einfach ausgedrückt, sie haben einen Weg entwickelt, mit dem Sie CRISPR mit Licht ein- und ausschalten können, um eine genauere Kontrolle seiner Aktivität zu ermöglichen. Sicherlich wird es hilfreich sein, Off-Target-Effekte zu reduzieren.

„Dies wurde erreicht, indem die lichtinduzierbaren heterodimerisierenden Proteine ​​​CRY2 und ​CIB1 an eine Transaktivierungsdomäne bzw. das katalytisch inaktive d​Cas9 fusioniert wurden.“ (Lauren R. Polstein & Charles A. Gersbach)

• Cpf1 soll Cas9 als Schneidprotein ersetzen (genauere Aktivität)

Dieser ist insofern etwas interessanter, als er eine direkte Änderung des CRISPR-Systems selbst darstellt. Cas9 war das Standard-Schnittprotein, das für das CRISPR-System verwendet wurde, obwohl es aufgrund seines etwas ungenauen Schneidens kontrovers diskutiert wurde. Cpf1 hat sich als präziser erwiesen (so sagen ihre Daten) und wird jetzt von einigen implementiert, um zu sehen, ob dies wirklich der Fall ist. In Kombination mit dem oben genannten „lichtinduzierten“ System bringt dies CRISPR auf ein sichereres Niveau, wenn es um Off-Target-Effekte geht.

Hier sind einige gute Online-Seminare für den Einstieg:

1. CRISPR/Cas9 von Anfang bis Ende
2. Verbessern Sie CRISPR-Cas9-Experimente mit rational entworfenen Leit-RNAs

Diese Seminare kann ich nicht wirklich direkt kommentieren, weil sie alles so gut für sich erklären. Alles, was ich sage, wird wirklich nur von dem ablenken, was sie lehren, da ich keineswegs ein Experte für CRISPR bin, sondern einfach jemand, der es möglicherweise für mein Labor verwendet. Im Moment gibt es eine Menge Anleitungsmaterial zur richtigen Formatierung Ihrer CRISPR-Experimente, aber meine persönliche Meinung ist, dass Sie der Technik vielleicht noch ein oder zwei Jahre geben sollten, wenn sie für die Forschung Standard ist.

Es sei denn, Sie möchten die Methode direkt erforschen und auf Ihre eigene Weise verbessern.

Lassen Sie mich wissen, ob dies Ihre Fragen ausreichend beantwortet.

Tut mir leid, dass ich nicht viel mehr tun kann, um die Links zu erklären. Die Studien sind keine, auf die ich leicht zugreifen kann, es sei denn, ich bin bei der Arbeit, da ich normalerweise über die Universität darauf zugreife.

Was den Reparaturmechanismus betrifft (Ihre Frage Nr. 3), kann ich das nicht wirklich mit Sicherheit beantworten, aber ich habe kürzlich eine Broschüre erhalten, in der beschrieben wird, wie sichergestellt werden kann, dass die Zellen HJ anstelle von NHEJ verwenden.