Verbesserung der DNA-Qualität und -Ausbeute von Stuhlproben

Ich habe genomische DNA aus Schweinekot präpariert, aber die Konzentration war sehr niedrig – etwa 3~4 ng/µl, als ich sie mit Nanodrop gemessen habe. Auch die Werte A260/A280für und A260/A230kamen nicht sehr gut heraus (0,4~0,5 bzw. 1,0). Ich habe auch versucht, die DNA zweimal zu filtern, aber es hat die Qualität nicht verbessert. Hat jemand Erfahrung mit der DNA-Extraktion aus Stuhlproben und schlägt mir vor, wie ich die Qualität und Ausbeute verbessern kann?

Antworten (1)

Die erwarteten photometrischen Verhältnisse für reine DNA liegen bei etwa 1,8 (A260/A280) und 2,0-2,2 (A260/A230). Als Referenz: Wenn Sie reine RNA extrahieren, beträgt das Verhältnis idealerweise 2,0 (A260/A280).

Niedrigere Verhältnisse weisen häufig auf eine geringe Reinheit aufgrund von Verunreinigungen oder einfach auf eine sehr geringe DNA-Menge hin.

EDTA, Kohlenhydrate und Phenol sowie andere Chemikalien haben alle eine Absorption bei 230 nm. Wenn Sie TRIzol-Reagenz zum Extrahieren von DNA verwendet haben, erhalten Sie möglicherweise auch eine gewisse Absorption von diesem Reagenz bei 270 nm, wenn Sie einen Teil der Phenolphase (rosa Zeug) oder die Grenzfläche (weißes trübes Zeug zwischen der wässrigen Phase und der rosa Phase) falsch pipettiert haben. Wenn Sie ein niedriges Verhältnis messen, wie Sie es getan haben, bedeutet dies wahrscheinlich, dass Sie in Ihrem endgültigen DNA-Extrakt (a) Dinge zu haben scheinen, die keine DNA in Ihrer Lösung sind, und / oder (b) eine sehr niedrige DNA-Konzentration.

Wenn Sie vermuten, dass Sie genug DNA haben, können Sie aufreinigen, um zu versuchen, Nicht-Nukleinsäuren zu entfernen. Bei so niedrigen Verhältnissen vermute ich jedoch, dass Sie DNA von Grund auf extrahieren sollten; es scheint nicht, dass du genug zu retten hast, indem du dich einfach wieder läuterst.

Mit welcher Methode haben Sie Ihre DNA extrahiert? Was meinst du mit filtern ?

Oh, ich habe kein Trizol-Reagenz verwendet. Ich habe ein kommerzielles Kit verwendet. Filtern bedeutet DNA-Bindung und Elution am Säulenrohr während des Experiments.
Sie verwenden Spin Columns, da bin ich mir sicher. Sie enthalten ein Silikaharz, das durch Variation der Salzbedingungen selektiv DNA bindet (RNA ist ebenfalls möglich). Sie passieren die Lösung mit Ihrer DNA durch Zentrifugieren, die DNA wird auf dem Harz eingeschlossen und eluieren dann die gebundene DNA mit einem zweiten Durchgang eines Elutionspuffers. Es ist eine ziemlich hochwertige Art, DNA aus einer Lösung zu reinigen, in meinen Händen funktioniert es besser als TRIzol-Extraktionen. Ich habe keine Ahnung, wie man aus Schweinekot eine mit Säulen bearbeitbare wässrige Lösung erhält. Im Prinzip sollte es gut funktionieren, wenn der Input gut genug ist. Entschuldigung, das ist alles, was ich habe!
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