Assay für Beta-Galactosidase-Aktivität in der Einzelzellmikroskopie

Ich möchte in der Lage sein, die Aktivität von zu messen β -Galactosidase in lebenden Zellen mit einfacher optischer (evtl. Fluoreszenz-)Mikroskopie. Idealerweise würde ich gerne ein Minimum an Gentechnik betreiben und diesen Assay mit Stämmen verwenden, die ich bereits habe (die ein WT-Laktosesystem haben), dh ein fluoreszierendes Laktosemimetikum wäre ideal. Außerdem wäre es schön, wenn die Lebensdauer des fluoreszierenden Nebenprodukts von β -gal-Aktivität war kurz, sodass ich eine Abnahme feststellen konnte β -gal Aktivität sowie eine Steigerung. Gibt es ein solches fluoreszierendes Analogon? Ich hoffe, den Wechsel von der Laktose- zur Glukoseverwertung unter dem Mikroskop betrachten zu können, also möchte ich, dass laktoseverbrauchende Zellen leuchten und glukoseverbrauchende Zellen dunkel sind oder umgekehrt. Es muss nicht vollständig quantitativ sein – ein qualitativer Sinn ist in Ordnung.

Antworten (3)

Ich habe dieses Papier gefunden .

Zhang GJ et al . (2009) Optische In-vivo -Bildgebung der LacZ-Expression unter Verwendung von lacZ-transgenen Mäusen. Assay Drug Dev Technol.7:391-9. doi: 10.1089/adt.2009.0195.

Abstrakt

beta-Galactosidase (beta-gal) (kodiert durch das lacZ-Gen) wurde weithin als transgenes Reporterenzym verwendet. Die Fähigkeit, die lacZ-Expression in lebenden transgenen Tieren abzubilden, würde die Verwendung dieses Reporters weiter erweitern. Es wurde berichtet, dass 7-Hydroxy-9H-(1,3-Dichlor-9,9-Dimethylacridin-2-on)-beta-d-galactopyranosid (DDAOG), ein Konjugat aus Beta-Galactose und 7-Hydroxy-9H -(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on), nicht nur ein chromogenes lacZ-Substrat ist, sondern dass das Spaltprodukt dunkelrote Fluoreszenzeigenschaften aufweist, die durch in vivo-Bildgebung nachweisbar sind. In einem Versuch, die lacZ-Expression in vivo nichtinvasiv abzubilden, wandten wir die Fluoreszenzbildgebung auf ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPR56), Knockout (KO)-Mausmodell an, bei dem das lacZ-Gen in den GPR56-Locus eingeführt wird. Im Vergleich zu Wildtyp (WT)-Mäusen, GPR56KO/LacZ-Mäuse zeigten 5 min nach Injektion von DDAOG in die Schwanzvene eine drei- bis vierfach höhere Fluoreszenzintensität im Kopfbereich. Die beta-Gal-Färbung in Schnitten des gesamten Gehirns zeigte eine starke lacZ-Expression in Homozygoten, aber nicht in WT-Mäusen, was mit der durch In-vivo-Bildgebung nachgewiesenen lacZ-Aktivität übereinstimmt. Die Nieren wurden auch mit Fluoreszenzbildgebung sowohl in vivo als auch ex vivo sichtbar gemacht, was mit den Ergebnissen der Beta-Gal-Färbung übereinstimmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzbildgebung für die In-vivo-Echtzeitdetektion der lacZ-Aktivität durch Fluoreszenzbildgebung in lacZ-transgenen Mäusen verwendet werden kann. Somit kann diese Technologie möglicherweise verwendet werden, um Änderungen bestimmter endogener Moleküle und/oder molekularer Signalwege in transgenen Tieren nichtinvasiv abzubilden. Die beta-Gal-Färbung in Schnitten des gesamten Gehirns zeigte eine starke lacZ-Expression in Homozygoten, aber nicht in WT-Mäusen, was mit der durch In-vivo-Bildgebung nachgewiesenen lacZ-Aktivität übereinstimmt. Die Nieren wurden auch mit Fluoreszenzbildgebung sowohl in vivo als auch ex vivo sichtbar gemacht, was mit den Ergebnissen der Beta-Gal-Färbung übereinstimmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzbildgebung für die In-vivo-Echtzeitdetektion der lacZ-Aktivität durch Fluoreszenzbildgebung in lacZ-transgenen Mäusen verwendet werden kann. Somit kann diese Technologie möglicherweise verwendet werden, um Änderungen bestimmter endogener Moleküle und/oder molekularer Signalwege in transgenen Tieren nichtinvasiv abzubilden. Die beta-Gal-Färbung in Schnitten des gesamten Gehirns zeigte eine starke lacZ-Expression in Homozygoten, aber nicht in WT-Mäusen, was mit der durch In-vivo-Bildgebung nachgewiesenen lacZ-Aktivität übereinstimmt. Die Nieren wurden auch mit Fluoreszenzbildgebung sowohl in vivo als auch ex vivo sichtbar gemacht, was mit den Ergebnissen der Beta-Gal-Färbung übereinstimmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzbildgebung für die In-vivo-Echtzeitdetektion der lacZ-Aktivität durch Fluoreszenzbildgebung in lacZ-transgenen Mäusen verwendet werden kann. Somit kann diese Technologie möglicherweise verwendet werden, um Änderungen bestimmter endogener Moleküle und/oder molekularer Signalwege in transgenen Tieren nichtinvasiv abzubilden. konsistent mit Beta-Gal-Färbungsbefunden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzbildgebung für die In-vivo-Echtzeitdetektion der lacZ-Aktivität durch Fluoreszenzbildgebung in lacZ-transgenen Mäusen verwendet werden kann. Somit kann diese Technologie möglicherweise verwendet werden, um Änderungen bestimmter endogener Moleküle und/oder molekularer Signalwege in transgenen Tieren nichtinvasiv abzubilden. konsistent mit Beta-Gal-Färbungsbefunden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzbildgebung für die In-vivo-Echtzeitdetektion der lacZ-Aktivität durch Fluoreszenzbildgebung in lacZ-transgenen Mäusen verwendet werden kann. Somit kann diese Technologie möglicherweise verwendet werden, um Änderungen bestimmter endogener Moleküle und/oder molekularer Signalwege in transgenen Tieren nichtinvasiv abzubilden.

Die Arbeit in der Veröffentlichung wird in einer neueren Veröffentlichung zitiert , in der über Beta-Gal-basierte Chemolumineszenz-Bildgebung bei Mäusen berichtet wird.

Es ist unklar, ob irgendetwas davon auf der Ebene einer einzelnen Bakterienzelle erfolgreich wäre.

Ich habe dies als Antwort gepostet, weil es für einen Kommentar zu lang war. Im Allgemeinen ist Ihr experimenteller Ansatz machbar, aber der Teufel steckt im Detail.

Zunächst wird Ihre größte Herausforderung darin bestehen, Zugang zu geeigneten Optiken zu erhalten. Die Abbildung einzelner eukaryotischer Zellen ist mit jedem beugungsbegrenzten optischen Mikroskop relativ einfach, da ihre Skala normalerweise 10-20 beträgt μ M. Bakterien haben eine viel kleinere Zellgröße und können (meistens) nicht mit beugungsbegrenzten Techniken auf Einzelzellebene abgebildet werden. Um eine einzelne Zelle abzubilden, sind superauflösende Optiken/Techniken erforderlich.

Zweitens klingt es so, als würden Sie diauxische Verschiebungskurven machen. Es ist möglicherweise nicht erforderlich, Bilder auf Einzelzellebene zu erstellen, und Sie können möglicherweise mit jedem mit einer Kamera ausgestatteten Mikroskop oder sogar einem optischen Plattenlesegerät, wie Sie erwähnt haben, gute Messungen von Zellen insgesamt durchführen β -gal.

@Alan Boyd wies auf ein chemilumineszentes Substrat hin β -gal, was gut funktionieren könnte, wenn Sie Zugriff auf einen optischen Imager haben, der Ihnen die Anzahl der Photonen pro Sekunde anzeigen kann. Dies würde Ihnen Messwerte der durchschnittlichen enzymatischen Aktivität geben (die Sie mit dem Expressionsniveau korrelieren können).

Außerdem beschreiben Sie, dass Zellen je nach verwendetem Substrat hell / dunkel sein sollen, und das wäre schwieriger zu erreichen. Ich stelle mir viele Möglichkeiten vor, dies zu tun, aber sie alle erfordern ein gewisses Maß an genetischer Manipulation. Vielleicht ist es am einfachsten, ein Expressionsplasmid herzustellen, das LacZ unter die Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors stellt. Diese Plasmide sind sehr verbreitet und würden Ihnen einen einfachen Einstieg in die Verwendung von Bildlaktose ermöglichen.

Danke für deine Antwort. Es stellt sich heraus, dass die Abbildung einzelner Bakterien nicht so viel zusätzliche Arbeit erfordert; Mein Labor macht es mit einem 60x Ölimmersionsobjektiv und nicht viel mehr. Obwohl Sie Recht haben, wird es wahrscheinlich ausreichen, ein weniger starkes Objektiv zu verwenden und aggregierte Zellen zu betrachten. Ich muss auch mikroskopieren, weil ich ein mikrofluidisches Gerät teste, das Zellen kontinuierlich mit frischem Medium versorgt; Ich versuche mir vorzustellen, wie schnell diese Nährstoffe durch das Gerät diffundieren.
Das gilt für die Bildgebung bei 60x, aber es erfordert, dass die Zellen für den individuellen Nachweis gut getrennt sind, und das ist bei Bakterien normalerweise nicht der Fall, insbesondere wenn sie aktiv wachsen. Allerdings waren die Auflösungsanforderungen eine große Mehrdeutigkeit. :) Wenn Sie ein mikrofuidisches Gerät verwenden, wird der Zucker mit dem Massenstrom eingespült. Würde das nicht viel schneller erfolgen als die Aufnahme und der Stoffwechsel in Bakterien?
Wenn Sie Ihre Probe vor der Mikroskopie verdünnen, ist es ziemlich einfach, einzelne Bakterien zu erkennen. Selbst wenn die OD ~ 0,1 war, konnte ich problemlos einzelne Bakterien sehen. Das mikrofluidische Gerät wäscht Nährstoffe über ein Agarpad; sie diffundieren durch das Pad zu den Bakterien. Ich weiß nicht, wie schnell das geht. Ich suche auch nach der Zeit, um vom Gerät zu den Bakterien zu diffundieren, und danach, wie sich die Nährstoffe im Laufe der Zeit durch den Agar (auf der Brennebene mit Bakterien) ausbreiten. Ungeachtet der Einzelheiten meiner Erfahrung suche ich nach Sonden für Beta-Gal-Aktivität, wie die, die Alan erwähnt hat.

Hier ist ein Link zur Webseite von Invitrogen/Life Technologies, auf der verschiedene Sonden zum Nachweis der Aktivität von Glykosidasen aufgeführt sind, einschließlich β -Galactosidase. Dazu gehören unter anderem DDAOG, wie von @Alan Boyd erwähnt, sowie Fluorescein Digalactosid, Resorufin Galactosid und Methylumbelliferyl Galactosid. NB, dies ist eine Website von Invitrogen/Life Technologies, daher werden alle erwähnten Reagenzien von der Firma verkauft; es kann andere geben, die hier nicht erwähnt werden. Von diesen ist DDAOG sehr stabil, was es ermöglichen würde, die Initiation von zu messen β -gal-Aktivität, funktioniert aber möglicherweise nicht, um Abnahmen zu messen β -gal-Aktivität (ohne den Farbstoff zu bleichen). Resorufin Galactosid ist bei physiologischem pH-Wert empfindlich und stabil, was eine Messung über einen langen Zeitraum ermöglicht. Fluorescein-Digalactosid ist der empfindlichste Assay, aber da es die Entfernung von 2 Galactose-Einheiten für eine vollständige Fluoreszenz erfordert, kann seine Aktivierungszeit langsam sein.

Für meine spezielle Verwendung (begrenzter Zugang zu fast roten Frequenzen) denke ich, dass Resorufin Galactosid oder Fluorescein Digalactosid die beste Wahl sein könnten. Angesichts der Kosten dieser Sonden wäre ich jedoch vielleicht besser dran, einfach ein Labor mit einem Stamm mit gfp unter dem lac-Promotor im Chromosom zu finden und sie um eine Probe zu bitten!

Assay für Beta-Galactosidase-Aktivität in der Einzelzellmikroskopie
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v