Gibt es eine zuverlässige Quelle für die Lagerung und Stabilität von Reduktionsmitteln wie DTT?

Thiolbasierte Reduktionsmittel

Die Instabilität von Reduktionsmitteln auf Thiolbasis in Lösung ist auf ihre Neigung zurückzuführen, Disulfidbindungen durch die folgende Halbreaktion zu bilden:

$$\ce{2RSH -> RSSR + 2H+ + 2e-}$$

Es ist klar, dass die Disulfidbildung erfordert:

• Deprotonierung der Thiole zu Thiolaten (RS ^– ).
• Ein Elektronenakzeptor.

Daher wären Lösungen von Reduktionsmitteln auf Thiolbasis am stabilsten, wenn:

• Der pH-Wert wird so gepuffert, dass die Thiolform vorherrscht. Der pKa des Thiols in β-Mercaptoethanol beträgt 9,5 und in Dithiothreitol 9,2 und 10,1 ( Whitesides et al., 1977 ). Das Puffern des niedrigeren pH-Werts sollte die Stabilität erhöhen.
• Elektronenakzeptoren werden entfernt. In wässriger Lösung ist der Elektronenakzeptor molekularer Sauerstoff. Das Entgasen des Puffers und das Lagern der Lösungen unter einem Inertgas wie Argon sollte die Stabilität erhöhen.
• Reaktionskatalysatoren werden entfernt. Zweiwertige Metallkationen, insbesondere Kupfer(II) (Cu ²⁺ ), katalysieren die sauerstoffabhängige Disulfidbildung, sogar in Spurenmengen ( Smith et al., 1994 ). Daher sollte ein Chelator wie EDTA die Stabilität erhöhen.
• Die Temperatur ist niedrig. Wie bei den meisten chemischen Reaktionen steigt die Geschwindigkeit mit der Temperatur.

Die Stabilitäten der Thiol-basierten Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol (β-ME), Dithiothreitol (DTT) und Glutathion (GSH) wurden in Lösung als Funktion des pH bei 20°C bestimmt ( Stevens et al., 1983 ):

...und Temperatur bei pH 8,5:

...sowie in Gegenwart von Kupfer (II) und EDTA bei pH 8,5 und 20°C:

Unten sind die tabellierten Rohdaten (dies sind die tatsächlichen Daten aus dem Papier, das ich verwendet habe, um die obigen Diagramme zu erstellen, aber beachten Sie, dass ich es schwierig fand, „>100“ darzustellen):

                               Half-life (h)        
pH    Temp (°C)    Additive    β-ME    DTT    GSH    
6.5   20           -           >100    40     16
7.5   20           -           10      10     9
8.5   20           -           4.0     1.4    1.3
8.5   0            -           21      11     8
8.5   40           -           1.0     0.2    0.2
8.5   20           Cu(II)      0.6     0.6    1.2
8.5   20           EDTA        >100    4      70

Wie erwartet nahm die Stabilität mit steigendem pH-Wert und steigender Temperatur sowie mit der Zugabe von Kupfer ab. Die Stabilität wurde durch die Zugabe von EDTA erhöht.

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Nicht auf Thiol basierende Reduktionsmittel

Han und Han (1994) untersuchten die Wirkung des pH-Werts und der Pufferzusammensetzung auf die Lösungsstabilität von Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP). Obwohl dies kein Reduktionsmittel auf Thiolbasis ist, unterliegt es dennoch der Oxidation. Es ist jedoch in Lösung ziemlich stabil:

pH    Solute/Buffer     % TCEP Oxidized After 3 Weeks
7.5   Tris-HCl          18.7 ± 0.6
8.5   Tris-HCl          16.8 ± 0.5
9.5   Tris-HCl          14.5 ± 0.5
8.2   borate             6.6 ± 0.2
10.2  borate             5.3 ± 0.1
6.8   HEPES             14.8 ± 0.4
8.2   HEPES             13.6 ± 0.3
9.7   CAPS               9.8 ± 0.3
11.1  CAPS               4.3 ± 0.1

Die Stabilität nahm mit steigendem pH-Wert zu, obwohl die Wirkung nicht groß war. Interessanterweise hatte die Pufferzusammensetzung einen größeren Einfluss auf die Stabilität, der bei Phosphat besonders ausgeprägt war:

        % TCEP Oxidized After 72 Hours
 pH     0.15 M phosphate    0.35 M phosphate
 6.0    not determined      11.2 ± 0.3
 6.8     8.1 ± 0.4          56.8 ± 2.3
 7.0    23.5 ± 0.9           100
 7.2    33.4 ± 1.0           100
 7.4    56.5 ± 1.4           100
 7.6    56.8 ± 2.1           100
 7.8    48.9 ± 2.5           100
 8.0    36.6 ± 1.7           100
10.6    not determined      11.7 ± 0.5
11.6    not determined       9.1 ± 0.4

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Verweise

Han JC, Han GY. 1994. Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tris(2-carboxyethyl)phosphin, einem geruchlosen Reduktionsmittel, stabiler und wirksamer als Dithiothreitol. AnalBiochem 220(1):5-10.

Smith RC, Schilf VD, Hill WE. 1994. Oxidation von Thiolen durch Kupfer(II). Phosphorus Sulfur Silicon Relat Elem 90(1-4):147-154.

Stevens R, Stevens L, Preis NC. 1983. The Stabilitys of Various Thiol Compounds Used in Protein Purifications. Biochemische Bildung 11(2):70.

Whitesides GM, Lilburn JE, Szajewski RP. 1977. Raten von Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen zwischen Mono- und Dithiolen und Ellman's Reagenz. J. Org. Chem. 42(2): 332-338.