Ist es möglich, anaerobe Medien zu reduzierend zu machen?

Ich habe Mühe, einen Anaerobier ( P. gingivalis ) zu züchten, ich treffe alle Vorsichtsmaßnahmen, um die Kulturbedingungen sauerstofffrei zu halten, ich habe mich gefragt, ob die Bedingungen so reduzierend sein können, dass sie das mikrobielle Wachstum eines obligaten Anaerobiers hemmen.

Um die flüssigen Medien herzustellen, gehe ich wie folgt vor:

  • TSB ergänzt mit Hefeextrakt
  • plus 0,5 g/L L-Cystein-HCl als Reduktionsmittel
  • plus Resazurin als Redoxindikator
  • Erhitzen Sie mit Stickstoff, bis das Resazurin vollständig farblos wird
  • Zugabe von Hämin (5 mg/L) und Vitamin K1 (1 mg/L) aus Stammlösungen (1mL/L Hämin in Wasser, 200µL/L Vit K1 in Ethanol)
  • Filtern Sie dieses Medium in Glasröhrchen, aus denen das Gas entfernt wurde (dies erfolgt in einer anaeroben Haube).
  • Alle Materialien (Spritzen, Nadeln, Filter, Schläuche) wurden vor Gebrauch in der anaeroben Haube belassen, damit kein Restsauerstoff darin/auf ihnen verbleibt
  • Tauschen Sie den Headspace gegen ein Gasgemisch aus 80:10:10 N 2 :CO 2 :H 2 aus

Ich bekomme kein Wachstum nach über 72 Stunden bei 37 o C.

Andere Protokolle, die ich gefunden habe, sind viel vager/nachlässiger in Bezug auf das Entfernen des Sauerstoffs. Viele sagen nur, dass das Cystein hinzugefügt werden sollte und die Medien vor der Verwendung 24 Stunden lang mit lockerem Deckel in einer anaeroben Haube inkubiert werden sollten. Das ließ mich denken, dass ich vielleicht zu viel Sauerstoff entferne.

Was denken Sie?

Für die Aufzeichnung, ich habe die Kultur heute wachsen lassen, ich habe den pH-Wert nach dem Durchblasen überprüft und festgestellt, dass er etwas niedrig war (6,6, es sollte wirklich 7,4 sein), also habe ich den pH-Wert vor dem Durchblasen auf etwa 8,0 ausgeglichen und der pH-Wert endete bei etwa 7,0. Ich denke, ich könnte es besser machen und Medien mit einem endgültigen pH-Wert von 7,4 haben, aber hey, es funktioniert!

Antworten (1)

Mir ist aufgefallen, dass Sie den pH-Wert nicht angeben, was wichtig sein könnte.

Ich weiß nicht, ob Sie zu viel Reduktionsmittel zugeben können (ich vermute nicht), aber oft ist ein großer Überschuss erforderlich, da die Gleichgewichtskonstanten für Disulfid-Austauschreaktionen typischerweise nahe bei Eins liegen (siehe Cleland , 1963).

Ich weiß auch nicht, ob einer der folgenden Punkte für Ihr Problem relevant ist (wiederum vermute ich nicht), aber ich möchte kurz zwei Aspekte der Verwendung von Thiolen als Reduktionsmittel im Allgemeinen kommentieren.

Erstens kann die oxidierte (Disulfid-) Form von Thiolen mit einem Protein-Sulfhydryl reagieren. Unter Verwendung von β-Mercaptoethanol als Beispiel ( Scopes , 1993, S. 320) kann etwas wie das Folgende auftreten, wo das Reduktionsmittel (reversibel) an Protein gebunden wird. Wenn sich das reaktive Sulfhydryl an einer aktiven Enzymstelle befindet, kann dies zu einer Inaktivierung führen.

(1) 2 H S C H X 2 − C H X 2 Ö H + Ö X 2 ⟶ H Ö C H X 2 C H X 2 − S − S − C H X 2 C H X 2 Ö H + H X 2 Ö X 2

(2) H Ö C H X 2 C H X 2 − S − S − C H X 2 C H X 2 Ö H + H S − Protein ↽ − − ⇀ H S C H X 2 − C H X 2 Ö H + H Ö C H X 2 C H X 2 − S − S − Protein  

Wie bereits erwähnt, liegen die Gleichgewichtskonstanten für Thiolaustauschreaktionen oft nahe bei Eins ( Cleland , 1963).,

(3) R X 1 − S − S − R X 2 + R X 3 − S H ↽ − − ⇀ R X 1 − S − S − R X 3 + R X 2 − S H  
Aus diesem Grund bevorzugen viele Proteinchemiker die Verwendung von Dithiolanaloga von Threitol (Dithiothreitol, DTT oder Cleland's Reagenz ) oder Erythritol als Reduktionsmittel, da die oxidierte Form dieser Verbindungen zyklische Disulfide sind, bei denen die Gleichgewichtskonstante nach rechts verschoben ist ( siehe Cleland , 1963).

Es stellt sich auch die Frage nach der Stabilität.

Die Halbwertszeit von Thiolen in Lösung ist deutlich pH- und temperaturabhängig, wie die nachstehende Tabelle zeigt. Die Halbwertszeit von β-Mercaptoethanol bei pH 6,5 und 20℃ ist größer als 100 Stunden, aber bei pH 8,5 und 20℃ beträgt sie nur 4 Stunden.

 

stevens_stevens_price über Disulfidstabilität

Die obige Tabelle stammt von Stevens, R., Stevens, L. & Price, NC (1983) The Stabilitys of Various Thiol Compounds Used in Protein Purifications , veröffentlicht in (inzwischen nicht mehr existierendem) Biochemical Education. Der vollständige Artikel ist als PDF auf der Wiley-Website frei verfügbar

Danke, das ist wirklich interessant, ich werde DTT als Standardreduktionsmittel verwenden. Ich denke, am Ende war das Problem der pH-Wert, ich würde ihn vor dem Sortieren auf 7,4 einstellen, aber dieser würde nach dem Durchblasen auf etwa 6,6 fallen. Ich bin mir nicht sicher, warum dies der Fall sein sollte, könnte Verdunstung sein oder etwas CO2 könnte sich auflösen. Wie auch immer, es scheint, dass Porphyromonas gingivalis einen pH-Wert eher um 7,5 bevorzugt
Ich denke, ich stimme Ihnen zu: dass Sie wahrscheinlich keine anaeroben Medien haben können, die für einen obligaten Anaerobier reduziert werden sollen. Somit sehe ich diese Frage als beantwortet an.
Ist es möglich, anaerobe Medien zu reduzierend zu machen?
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